Functionele isolatie van enkele motoreenheden van Rat Medial Gastrocnemius Muscle
Summary
Deze methode maakt het mogelijk de opname van de kracht van twitch en tetanische contracties en actie potentialen in drie soorten motorische eenheden in de rat mediale gastrocnemius spier. De functionele isolatie van een enkele motorunit wordt veroorzaakt door elektrische stimulatie van de axon.
Abstract
Dit werk schetst functionele isolatie van motoreenheden (MU’s), een standaard elektrofysiologische methode voor het bepalen van de kenmerken van motoreenheden in achterpootspieren (zoals de mediale gastrocnemius, soleus of plantarisspier) bij experimentele ratten. Een cruciaal element van de methode is de toepassing van elektrische stimuli geleverd aan een motor axon geïsoleerd van de ventrale wortel. De stimuli kunnen worden geleverd bij constante of variabele interpulssies. Deze methode is geschikt voor experimenten op dieren in verschillende stadia van rijpheid (jong, volwassen of oud). Bovendien kan dit protocol worden gebruikt in experimenten waarbij variabiliteit en plasticiteit van motoreenheden worden onderzocht die door een groot spectrum van interventies worden opgeroepen. De resultaten van deze experimenten kunnen zowel het vergroten van de basiskennis in de spierfysiologie en worden vertaald in praktische toepassingen. Deze procedure richt zich op de chirurgische voorbereiding voor de registratie en stimulatie van MU’s, met de nadruk op de nodige stappen om voorbereidingsstabiliteit en reproduceerbaarheid van de resultaten te bereiken.
Introduction
Motoreenheden (MU’s) zijn de kleinste functionele eenheden van skeletspieren. Daarom is het begrijpen van hun functie, plasticiteit en contractiele eigenschappen, evenals de mechanismen van hun krachtregulatie, cruciaal voor vooruitgang in de spierfysiologie. De basiscontractieleigenschappen van M’s en de verhoudingen van hun fysiologische types zijn gedocumenteerd voor tal van spieren, voornamelijk de achterpootspieren bij proefdieren. Echter, zowel de plasticiteit van MU eigenschappen en de mechanismen van MU kracht regelgeving zijn nog steeds niet volledig begrepen.
Het principe van de beschreven methode is uitgebreide denervation van de achterpootspieren behalve de onderzochte en laminectomie bij de lendenwervels om dunne ventrale worteltjes voor te bereiden, elk met een enkele “functionele” motoraxon, gestimuleerd om de kracht en het actiepotentieel van het MU vast te leggen. Met behulp van de techniek beschreven in dit document, is het mogelijk om meer dan de helft van de MUs van de mediale gastrocnemius spier te isoleren in een succesvol experiment. De rattenmediale gastrocnemius bestaat uit gemiddeld 52 MU’s (vrouwtjes) of 57 MU’s (mannetjes) van drie fysiologische types: S (langzaam), FR (snel resistent) en FF (snel vetbaar)1,2, en hebben variabele contractiele eigenschappen3. Voor experimenten waarbij gemiddelde waarden voor MU’s in de controle- en experimentele groepen worden vergeleken, zijn isolatie en registratie van 10-30 MU’s voor elk van deze groepen noodzakelijk. Kritisch, individuele MU’s kunnen toegankelijk zijn voor stimulatie voor perioden van meer dan een uur. Bovendien, aangezien deze techniek het mogelijk maakt voor het registreren van zowel MU kracht en actie mogelijkheden, deze methode is geschikt voor het bestuderen van verschijnselen in verband met kracht productie, het beoordelen van het effect van vermoeidheid, en het observeren van de relatie tussen de kracht en actie mogelijkheden.
Eerdere studies hebben bevestigd dat MU contractiele eigenschappen zijn plastic en kan worden gemoduleerd door tal van interventies. Experimenten met behulp van de hier beschreven techniek zijn uitgevoerd op rat mediale gastrocnemius4 of andere achterpootspieren van de rat5,6 en op kat spieren7, met behulp van een soortgelijke methode van enkele MU isolatie. Een andere reeks experimenten met treinen van stimuli die bij variabele interpulsintervallen werden uitgevoerd, leverden waarnemingen op met betrekking tot motorische controleprocessen, en de resultaten in het algemeen richten de aandacht op de geschiedenis van stimulatie, met inbegrip van aanzienlijke effecten van een verschuiving in tijdschaal van zelfs één stimulus, cruciaal voor krachtproductie8,9.
M’s kunnen ook worden bestudeerd met behulp van alternatieve methoden. Ten eerste, een methode is directe stimulatie van motoneurons. Burke gebruikte intracellulaire stimulatie van motoneurons in cat medial gastrocnemius en soleus met glasmicro-elektroden die parallel worden gebruikt om de elektrofysiologische eigenschappen van deze neuronen1,10te bepalen. Andere methoden zijn voorgesteld om MUs studie in menselijke spieren, die aanzienlijk lagere interventie vereisen. Voor al deze methoden, de stimulerende en opnames elektroden worden ingevoegd in de spier of zenuw, en kracht wordt geregistreerd van de vinger of van de voet. De eerste van deze methoden werd gebruikt om MUs te bestuderen in de eerste dorsale interosseous spier. Voor deze spier, samentrekkend met een lage kracht, in het elektromyogram geregistreerd met de naald elektrode ingevoegd in de spier de actie mogelijkheden van slechts een actieve motorische eenheid werden geïdentificeerd. Vervolgens werden de fragmenten van een spierkracht die parallel en na elk actiepotentieel werden geregistreerd, gemiddeld (spike-triggered middeling). Deze methode maakt extractie van de kracht van een motorische eenheid uit de spierkracht opname11. Echter, de methodologische zwakte van deze procedure is dat er geen enkele twitch kracht, maar eerder fragmenten van tetanische weeën werden gemiddeld. Menselijke MUs kan ook worden bestudeerd met behulp van de tweede methode van intramusculaire elektrische microstimulatie met behulp van een elektrode ingevoegd in de spier12, die een fragment van een axonale boom stimuleert, wat leidt tot activering van een enkele motorunit. De derde methode is microstimulatie met een elektrode ingebracht in de zenuw. Wanneer de elektrode slechts één motoraxon in de zenuw activeert, komt slechts één motorunit samen13. Deze laatste methoden hebben een aantal beperkingen, waaronder stabiliteit en kwaliteit van de opname, ethische beperkingen en toegang tot het experimentele materiaal. Dit protocol is op grote schaal gebruikt bij katten in de jaren ’70 en ’8014.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indien correct uitgevoerd door ervaren wetenschappers, moet de chirurgische component van het beschreven protocol binnen ongeveer twee uur worden voltooid. Men moet bijzondere zorg besteden aan het handhaven van stabiele fysiologische omstandigheden van het dier tijdens de operatie, met name lichaamstemperatuur en diepte van anesthesie, die systematisch moet worden gecontroleerd door het beoordelen van pinna en ontwenningsreflexen. Na de operatie moet het mogelijk zijn om gedurende ten minste zes uur stabiele opnameomsta…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Poolse Nationale Onderzoekscentrum subsidie 2018/31/B/NZ7/01028.
Materials
| Force transducer | custom-made | ||
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11255-20 | Dumont #55 with extra light and fine shanks |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11150-10 | Extra Fine Greafe Forceps |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11026-15 | Special cupped pattern for superior grip |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11023-10 | Slim 1×2 teeth |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11251-20 | Dumont #5 |
| Hemostats | Fine Science Tools | No. 13003-10 | Hartman |
| Isolation Unit | Grass Instruments | S1U5A | |
| Low Noise Bioamplifer | World Precision Instruments | Order code 74030 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | No. 12503-15 | With tungsten carbide jaws |
| Rongeurs | Fine Science Tools | No. 16021-14 | Friedman-Pearson |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14101-14 | Straight sharp/blunt with large finger loops |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14075-11 | Curved blunt/blunt |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14084-08 | Extra fine bonn |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 15000-00 | Straight, ideal for cutting nerves |
| Stimulator | Grass Instruments | S88 | Dual Output Square Pulse Stimulator |
Riferimenti
- Burke, R. E., Levine, D. N., Tsairis, P., Zajac, F. E. Physiological types and histochemical profiles in motor units of the cat gastrocnemius. Journal of Physiology. 234, 723-748 (1973).
- Celichowski, J., Drzymała-Celichowska, H. The number of motor units in the medial gastrocnemius muscle of male and female rats. Journal of Physiology and Pharmacology. 58, 821-828 (2007).
- Grottel, K., Celichowski, J. Division of motor units in medial gastrocnemius muscle of the rat in light of variability of their principal properties. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 50, 571-588 (1990).
- Celichowski, J., Krutki, P. Variability and plasticity of motor unit properties in mammalian skeletal muscle. Biocybernetics and Biomedical Engineering. 32 (4), 33-45 (2012).
- Gardiner, P. F., Olha, A. E. Contractile and electromyographic characteristics of rat plantaris motor unit types during fatigue in situ. Journal of Physiology. 385, 13-34 (1987).
- Drzymała-Celichowska, H., Kaczmarek, P., Krutki, P., Celichowski, J. Summation of slow motor unit forces at constant and variable interpulse intervals in rat soleus muscle. Journal of Electromyography and Kinesiology. 30, 1-8 (2016).
- Krutki, P., Celichowski, J., Łochyński, D., Pogrzebna, M., Mrówczyński, W. Interspecies differences of motor units properties in the medial gastrocnemius muscle of cat and rat. Archives Italiennes de Biologie. 144, 11-23 (2006).
- Burke, R. E., Rudomin, P., Zajac, F. E. The effect of activation history on tension production by individual muscle units. Brain Research. 109, 515-529 (1976).
- Celichowski, J. Mechanisms underlying the regulation of motor unit contraction in the skeletal muscle. Journal of Physiology and Pharmacology. 51, 17-33 (2000).
- Burke, R. E., Levine, D. N., Salcman, M., Tsairis, P. Motor units in cat soleus muscle: physiological, histochemical and morphological characteristics. Journal of Physiology. 238, 503-514 (1974).
- Milner-Brown, H. S., Stein, R. B., Yemm, R. The contractile properties of human motor units during voluntary isometric contractions. Journal of Physiology. 228, 285-306 (1973).
- Taylor, A., Stephens, J. A. Study of human motor unit contractions by controlled intramuscular microstimulation. Brain Research. 117, 331-335 (1976).
- Westling, G., Johansson, R. S., Thomas, C. K., Bigland-Ritchie, B. Measurement of contractile and electrical properties of single human thenar motor units in response to intraneural motor-axon stimulation. Journal of Neurophysiology. 64, 1331-1338 (1990).
- Burke, R. E. Motor units: anatomy, physiology and functional organization. APS Handbook of Physiology Series, Section 1, The Nervous System. 11, 345-422 (1981).
- Celichowski, J., Grottel, K. The dependence of the twitch course of medial gastrocnemius muscle of the rat and its motor units on stretching of the muscle. Archives Italiennes de Biologie. 130, 315-325 (1992).
- Celichowski, J., Grottel, K., Bichler, E. Differences in the profile of unfused tetani of fast motor units with respect to their resistance to fatigue in the rat medial gastrocnemius muscle. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 20, 681-685 (1999).
- Krutki, P., et al. Division of motor units into fast and slow on the basis of profile of 20 Hz unfused tetanus. Journal of Physiology and Pharmacology. 59, 353-363 (2008).
- Drzymała-Celichowska, H., Krutki, P., Celichowski, J. Summation of motor unit forces in the rat medial gastrocnemius muscle. Journal of Electromyography and Kinesiology. 20, 599-607 (2010).
- Kaczmarek, P., Celichowski, J., Drzymała-Celichowska, H., Kasiński, A. The image of motor unit architecture in the mechanomyographic signal during single motor unit contraction. In vivo and simulation study. Journal of Electromyography and Kinesiology. 19, 553-563 (2009).
- Celichowski, J., Krutki, P., Bichler, E. Axonal conduction velocity of motor units of rat’s medial gastrocnemius muscle. Journal of Physiology (Paris). 90, 75-78 (1996).
