Summary

Murine Excisional Wound Healing Model en Histological Morphometric Wound Analysis

Published: August 21, 2020
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft hoe bilaterale excisionale wonden met volledige dikte bij muizen kunnen worden gegenereerd en hoe u de wonden vervolgens controleren, oogsten en voorbereiden op morfometrische analyse. Inbegrepen is een diepgaande beschrijving van het gebruik van seriële histologische secties om morfometrische defecten te definiëren, nauwkeurig te kwantificeren en op te sporen.

Abstract

Het murine excisional wondmodel is op grote schaal gebruikt om elk van de sequentiële overlappende fasen van wondgenezing te bestuderen: ontsteking, proliferatie en remodellering. Murine wonden hebben een histologisch goed gedefinieerde en gemakkelijk herkenbare wondbed waarover deze verschillende fasen van het genezingsproces meetbaar zijn. Binnen het veld is het gebruikelijk om een willekeurig gedefinieerd “midden” van de wond te gebruiken voor histologische analyses. Wonden zijn echter een driedimensionale entiteit en vaak niet histologisch symmetrisch, wat de noodzaak van een goed gedefinieerde en robuuste kwantificeringsmethode ondersteunt om morfometrische defecten met een kleine effectgrootte te detecteren. In dit protocol beschrijven we de procedure voor het maken van bilaterale excisionale wonden met volledige dikte bij muizen, evenals een gedetailleerde instructie over het meten van morfometrische parameters met behulp van een beeldverwerkingsprogramma op geselecteerde seriële secties. De metingen met twee dimensies van wondlengte, opperhuidlengte, opperhuidgebied en wondgebied worden gebruikt in combinatie met de bekende afstand tussen secties om het epidermale gebied met drie dimensies dat de wond, het totale wondgebied, het oppervolume en het wondvolume bedekt, te extrapoleren. Hoewel deze gedetailleerde histologische analyse meer tijd en middelen verbruikt dan conventionele analyses, verhoogt de strengheid de kans op het detecteren van nieuwe fenotypes in een inherent complex wondgenezingsproces.

Introduction

Cutane wondgenezing is een complex biologisch proces met sequentieel overlappende fasen. Het vereist de coördinatie van cellulaire en moleculaire processen die tijdelijk en ruimtelijk worden gereguleerd om de barrièrefunctie van het beschadigde epitheel te herstellen. In de eerste fase migreren ontstekingen, neutrofielen en macrofagen naar de wond en mobiliseren lokale en systemische afweer1. Het volgen en overlappen van de ontstekingsfase is de proliferatiefase. Fibroblasten beginnen zich snel te vermenigvuldigen en migreren naar het granulatieweefsel. Keratinocyten uit de buurt van de voorste rand directioneel vermenigvuldigen naar de wond als gedifferentieerde keratinocyten in de voorste rand migreren naar re-epithialize de wond2. Ten slotte begint de remodellerings- en rijpingsfase, waarbij fibroblasten in het granulatieweefsel collageen beginnen te synthetiseren en deponeren. De verbouwing en organisatie van de nieuwe matrix kan tot 1 jaar duren na letsel3. Vanwege de complexiteit van overlappende gebeurtenissen waarbij cross-talk tussen meerdere celtypen, en ondanks jaren van onderzoek, veel van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan wondgenezing blijven slecht begrepen.

Het muismodel is het overheersende zoogdiermodel voor het onderzoeken van mechanismen van wondgenezing vanwege hun gebruiksgemak, relatief lage kosten en genetische manipulabiliteit1,4,5. Hoewel verschillende soorten wonden zijn beschreven in het murine model, de meest voorkomende is een excisional wond (ofwel bilaterale punch of directe punch biopsie), gevolgd door incisional wound modellen4. De excisional wond model heeft een duidelijk voordeel ten opzichte van de incisie model als het inherent genereert controleweefsel dat niet heeft ondergaan het genezingsproces. De punch biopsie weefsel dat wordt verwijderd als onderdeel van het chirurgische protocol kan worden verwerkt op dezelfde manier als het gewonde weefsel en gebruikt om de homeostatische omstandigheden vast te stellen voor een gewenst criterium. Uitgesneden controleweefsel kan ook nuttig zijn bij het beoordelen van de effecten van een voorbehandeling van de huid of het bevestigen van een succesvolle genwijziging op het moment van letsel4.

Helende parameters kunnen worden beoordeeld door veel verschillende technieken, waaronder planimetrie of histologie. Planimetrie kan echter alleen de zichtbare kenmerken van de wond evalueren, en vanwege de aanwezigheid van een korst, correleert vaak niet met metingen van genezing die worden gevisualiseerd door histologie, waardoor histologie de “gouden standaard” van analyse4wordt. Ondanks histologische analyse is de gouden standaard, het wordt meestal uitgevoerd op een willekeurige subset van de wond6,7. Bijvoorbeeld, het snijden van de wond in “helft” voorafgaand aan het inbedden en doorsnijden van de wond is momenteel gebruikelijk om de tijd en middelen die worden besteed aan het doorsnijden van materialen en gegevensanalyse te verminderen. De in dit protocol beschreven methode van morfometrische analyse werd ontwikkeld om het volledige wondweefsel te omvatten, om de morfologische kenmerken van de wond nauwkeurig weer te geven en de kans op het detecteren van wondgenezingsdefecten met een kleine effectgrootte te vergroten. In dit protocol beschrijven we een chirurgische methode voor het genereren van de meest bestudeerde murinewond, de bilaterale excisionale wond met volledige dikte, evenals een gedetailleerde en rigoureuze methode voor histologische analyse die zelden in het veld wordt gebruikt.

Protocol

Alle experimenten werden voltooid in overeenstemming met de federale regelgeving en de Universiteit van Iowa beleid en procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Iowa IACUC. 1. Dieren en veeteelt Gebruik volwassen muizen van de gewenste muislijn op 8-10 weken oud wanneer het haarzakje stadium is in telogen. Op de dag van de operatie, scheiden muizen in schone kooien en individueel huis om wondverstoring te minimaliseren. 2. Chirurgi…

Representative Results

Figuur 5 toont het bereik in gemeten en berekende waarden verkregen door het uitvoeren van morfometrische analyse op wilde wonden gegenereerd in verschillende muizenstammen door meerdere chirurgen en geanalyseerd door verschillende individuen. Wild-type muizen van verschillende stammen kunnen statistische verschillen vertonen zoals beschreven in zowel onze studies als in de literatuur9,10. Op basis van deze representatieve resultaten…

Discussion

Het bilaterale excisional wondmodel is een zeer aanpasbare procedure die kan worden gebruikt om veel verschillende aspecten van wondgenezing te bestuderen. Voordat ze met een wondhelend project beginnen, moeten onderzoekers een energieanalyse uitvoeren om het aantal wonden te bepalen dat nodig is om een defect van een bepaalde effectgrootte op te sporen. Inconsistenties bestaan in de literatuur over de vraag of individuele muizen of wonden moeten worden gebruikt als biologische replica’s, echter, een recente studie toond…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn alle leden van het Dunnwald Lab dankbaar die in de loop der jaren hebben bijgedragen aan de optimalisatie van dit protocol, en aan Gina Schatteman wiens volharding in het bevorderen van het gebruik van seriële secties voor wondanalyse de oprichting ervan mogelijk heeft gemaakt. Dit werk werd ondersteund door financiering van NIH/NIAMS aan Martine Dunnwald (AR067739).

Materials

100% ethanol
70% ethanol
80% ethanol
95% ethanol
Alcohol Prep NOVAPLUS V9100 70% Isopropyl alcohol, sterile
Ammonium hydroxide
Biopsy pads Cellpath 22-222-012
Black plastic sheet Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper
Brightfield microscope With digital acquisition capabilities and a 4X objective
Cotton tipped applicators
Coverslips 22 x 60 #1
Dental wax sheets
Digital camera Include a ruler for scale, if applicable
Dissection teasing needle (straight)
Embedding molds 22 x 22 x 12
Embedding rings Simport Scientific Inc. M460
Eosin Y
Glacial acetic acid
Hair clipper
Heating pad Conair Moist dry Heating Pad
Hematoxylin
Microtome
Microtome blades
Paint brushes
Paraffin Type 6
Paraformaldehyde
Permount
Phosphate buffer solution (PBS)
Povidone-iodine Aplicare 82-255
Processing cassette Simport Scientific Inc. M490-2
Razor blades ASR .009 Regular Duty
Scalpel blades #10
Scalpel handle
Sharp surgical scissors sterile for surgery
Skin biopsy punches Size as determined by researcher
Slide boxes
Slide warmers
Superfrosted microscope slides Fisher Scientific 22 037 246
Temperature control water bath
Tissue embedding station Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate
Tissue processor Minimum of a oven with a vacuum pump
Triple antibiotic opthalmic ointment
tweezers, curved tip sterile for surgery
tweezers, tapered tip sterile for surgery
WypAll X60 Kimberly-Clark 34865

Riferimenti

  1. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  2. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  3. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  4. Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
  5. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  6. Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
  7. Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
  8. Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
  9. Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
  10. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
  11. Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
  12. Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
  13. Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
  14. Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
  15. Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
  16. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  17. Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
  18. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  19. Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
check_url/it/61616?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Rhea, L., Dunnwald, M. Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis. J. Vis. Exp. (162), e61616, doi:10.3791/61616 (2020).

View Video