Murine Excisional Wound Healing Model und histologische morphometrische Wundanalyse
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie bilaterale, volldicke Exzisionswunden bei Mäusen erzeugt werden und wie man anschließend die Wunden für die morphometrische Analyse überwacht, erntet und vorbereitet. Enthalten ist eine ausführliche Beschreibung der Verwendung von seriellen histologischen Abschnitten zur Definition, präzisen Quantifizierung und Erkennung morphometrischer Defekte.
Abstract
Das murine excisionale Wundmodell wurde ausgiebig verwendet, um jede der sequenziell überlappenden Phasen der Wundheilung zu untersuchen: Entzündung, Proliferation und Umbau. Murine Wunden haben ein histologisch gut definiertes und leicht erkennbares Wundbett, über das diese verschiedenen Phasen des Heilungsprozesses messbar sind. Innerhalb des Feldes ist es üblich, eine willkürlich definierte “Mitte” der Wunde für histologische Analysen zu verwenden. Wunden sind jedoch ein dreidimensionales Gebilde und oft nicht histologisch symmetrisch, was die Notwendigkeit einer klar definierten und robusten Methode der Quantifizierung zur Erkennung morphometrischer Defekte mit geringer Effektgröße unterstützt. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren zum Erstellen bilateraler, volldickender Exzisionswunden bei Mäusen sowie eine detaillierte Anleitung zur Messung morphometrischer Parameter mithilfe eines Bildverarbeitungsprogramms auf ausgewählten seriellen Abschnitten. Die zweidimensionigen Messungen von Wundlänge, epidermaler Länge, epidermaler Fläche und Wundfläche werden in Kombination mit dem bekannten Abstand zwischen abschnittsweise verwendet, um den dreidimensionigen epidermalen Bereich zu extrapolieren, der die Wunde, die gesamte Wundfläche, das epidermale Volumen und das Wundvolumen abdeckt. Obwohl diese detaillierte histologische Analyse zeitaufwändiger ist als herkömmliche Analysen, erhöht ihre Strenge die Wahrscheinlichkeit, neuartige Phänotypen in einem inhärent komplexen Wundheilungsprozess zu erkennen.
Introduction
Die Hautwundheilung ist ein komplexer biologischer Prozess mit sequenziell überlappenden Phasen. Es erfordert die Koordination zellulärer und molekularer Prozesse, die zeitlich und räumlich reguliert werden, um die Barrierefunktion des beschädigten Epithels wiederherzustellen. In der ersten Phase wandern Entzündungen, Neutrophile und Makrophagen in die Wunde und mobilisieren lokale und systemische Abwehrkräfte1. Nach und überlappend ist die Entzündliche Phase das Proliferationsstadium. Fibroblasten beginnen sich schnell auszumehren und in das Granulationsgewebe zu wandern. Keratinozyten weg von der Vorderkante, die sich richtungsweisend zur Wunde ausbreiten, während differenzierte Keratinozyten in der Vorderkante wandern, um die Wunde2wieder zu epithelisieren. Schließlich beginnt die Umbau- und Reifungsphase, in der Fibroblasten im Granulationsgewebe zu synthetisieren und Kollagen ablagern. Der Umbau und die Organisation der neuen Matrix kann bis zu 1 Jahr nach Verletzungdauern 3. Aufgrund der Komplexität überlappender Ereignisse mit Cross-Talk zwischen mehreren Zelltypen und trotz jahrelanger Forschung bleiben viele der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Wundheilung zugrunde liegen, schlecht verstanden.
Das Mausmodell ist das vorherrschende Säugetiermodell zur Untersuchung von Mechanismen der Wundheilung aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, relativ niedrigen Kosten und genetischen Manipulierbarkeit1,4,5. Obwohl verschiedene Arten von Wunden im murinen Modell beschrieben wurden, ist die häufigste eine exzistive Wunde (entweder bilateraler Schlag oder direkte Schlagbiopsie), gefolgt von Inzisionswundmodellen4. Das exzisionale Wundmodell hat einen deutlichen Vorteil gegenüber dem Inzisionsmodell, da es von Natur aus Kontrollgewebe erzeugt, das den Heilungsprozess nicht durchlaufen hat. Das im Rahmen des Operationsprotokolls ausgeschnittene Schlagbiopsiegewebe kann auf die gleiche Weise wie das verwundete Gewebe verarbeitet und zur Ermittlung der otostatischen Bedingungen für ein gewünschtes Kriterium verwendet werden. Verbrauchgesteuertes Kontrollgewebe kann auch nützlich sein, wenn die Auswirkungen einer Hautvorbehandlung beurteilt oder eine erfolgreiche Genveränderung zum Zeitpunkt der Verletzung bestätigt wird4.
Heilparameter können mit vielen verschiedenen Techniken bewertet werden, einschließlich Planimetrie oder Histologie. Die Planimetrie kann jedoch nur sichtbare Eigenschaften der Wunde bewerten und korreliert aufgrund des Vorhandenseins eines Schorfes oft nicht mit Messungen der Heilung, die durch histologische Visualisierung visualisiert werden, wodurch die Histologie zum “Goldstandard” der Analyse4wird. Obwohl die histologische Analyse der Goldstandard ist, wird sie am häufigsten auf einer beliebigen Teilmenge der Wunde6,7durchgeführt. Zum Beispiel ist das Schneiden der Wunde in “halb” vor dem Einbetten und Schneiden der Wunde derzeit gängige Praxis, um den Zeit- und Ressourcenaufwand für das Schneiden von Materialien und die Datenanalyse zu reduzieren. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode der morphometrischen Analyse wurde entwickelt, um das gesamte Wundgewebe zu umfassen, die morphologischen Eigenschaften der Wunde genau widerzuspiegeln und die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, Wundheilungsdefekte mit einer geringen Effektgröße zu erkennen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine chirurgische Methode zur Erzeugung der am häufigsten untersuchten murinen Wunde, der bilateralen Volldicke excisionalwunde, sowie eine detaillierte und strenge Methode für die histologische Analyse, die selten auf dem Feld verwendet wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das bilaterale Exzisions-Wundmodell ist ein hochgradig anpassbares Verfahren, das verwendet werden kann, um viele verschiedene Aspekte der Wundheilung zu studieren. Bevor die Ermittler ein Wundheilungsprojekt beginnen, sollten sie eine Leistungsanalyse durchführen, um die Anzahl der Wunden zu ermitteln, die erforderlich sind, um einen Defekt einer bestimmten Effektgröße zu erkennen. In der Literatur gibt es Ungereimtheiten darüber, ob einzelne Mäuse oder Wunden als biologische Repliken verwendet werden sollten, jedo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Mitgliedern des Dunnwald Lab, die im Laufe der Jahre zur Optimierung dieses Protokolls beigetragen haben, und Gina Schatteman, deren Beharrlichkeit bei der Förderung des Einsatzes von seriellen Sektionen für die Wundanalyse seine Entstehung ermöglichte. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel von NIH/NIAMS an Martine Dunnwald (AR067739) unterstützt.
Materials
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
Riferimenti
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