मुरीन एक्सिसिओनल घाव हीलिंग मॉडल और हिस्टोलॉजिकल मॉर्फोमेट्रिक घाव विश्लेषण

Summary

यह प्रोटोकॉल चूहों में द्विपक्षीय, पूर्ण मोटाई के उत्तेजना घावों को कैसे उत्पन्न करता है और बाद में मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए घावों की निगरानी, फसल और तैयार करने का तरीका बताता है। शामिल कैसे धारावाहिक हिस्टोलॉजिकल वर्गों का उपयोग करने के लिए परिभाषित करने के लिए, ठीक मात्रा और रूपोमेट्रिक दोषों का पता लगाने का एक में गहराई से वर्णन है ।

Abstract

सूजन, प्रसार और रीमॉडलिंग: घाव भरने के क्रमिक रूप से अतिव्यापी चरणों में से प्रत्येक का अध्ययन करने के लिए मुरीन एक्ससिओनल घाव मॉडल का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। मुरीन घावों में एक हिस्टोलॉजिकल रूप से अच्छी तरह से परिभाषित और आसानी से पहचानने योग्य घाव बिस्तर होता है जिस पर उपचार प्रक्रिया के ये विभिन्न चरण औसत दर्जे के होते हैं। क्षेत्र के भीतर, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषणों के लिए घाव के मनमाने ढंग से परिभाषित “मध्य” का उपयोग करना आम बात है। हालांकि, घाव एक त्रि-आयामी इकाई हैं और अक्सर हिस्टोलॉजिकल रूप से सममित नहीं होते हैं, जो एक छोटे प्रभाव आकार के साथ रूपोमेट्रिक दोषों का पता लगाने के लिए मात्राकरण की एक अच्छी तरह से परिभाषित और मजबूत विधि की आवश्यकता का समर्थन करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम चूहों में द्विपक्षीय, पूर्ण मोटाई के उत्तेजनीय घावों को बनाने के साथ-साथ चुनिंदा धारावाहिक वर्गों पर एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का उपयोग करके मॉर्फोमेट्रिक मापदंडों को मापने के बारे में एक विस्तृत निर्देश का वर्णन करते हैं। घाव की लंबाई, एपिडर्मल लंबाई, एपिडर्मल क्षेत्र और घाव क्षेत्र के दो आयाम मापों का उपयोग घाव, समग्र घाव क्षेत्र, एपिडर्मल वॉल्यूम और घाव की मात्रा को कवर करने वाले तीन आयाम एपिडर्मल क्षेत्र को एक्सट्रपलेट करने के लिए वर्गों के बीच ज्ञात दूरी के संयोजन में किया जाता है। यद्यपि यह विस्तृत हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण पारंपरिक विश्लेषणों की तुलना में अधिक समय और संसाधन लेने वाला है, इसकी कठोरता स्वाभाविक रूप से जटिल घाव उपचार प्रक्रिया में उपन्यास फेनोटाइप का पता लगाने की संभावना को बढ़ाती है।

Introduction

क्यूटेनियस घाव उपचार क्रमिक रूप से ओवरलैपिंग चरणों के साथ एक जटिल जैविक प्रक्रिया है। यह सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं है कि अस्थायी और स्थानिक रूप से विनियमित कर रहे है ताकि क्षतिग्रस्त epithelium के बाधा समारोह को बहाल करने के समन्वय की आवश्यकता है । पहले चरण में, सूजन, न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज घाव में स्थानांतरित हो जाते हैं, स्थानीय और प्रणालीगत सुरक्षा¹जुटाते हैं। भड़काऊ चरण के बाद और ओवरलैपिंग प्रसार चरण है। फाइब्रोब्लास्ट तेजी से बढ़ने लगते हैं और ग्रैनुलेशन ऊतक में माइग्रेट होते हैं। केराटिनोसाइट्स अग्रणी किनारे से दूर दिशात्मक रूप से घाव की ओर फैलते हैं क्योंकि अग्रणी किनारे में विभेदित केराटिनोसाइट्स घाव को फिर से एपिथेलाइज करने के लिए माइग्रेट करते हैं^2। अंत में, रिमॉडलिंग और परिपक्वता चरण शुरू होता है, जिसके दौरान ग्रेनुलेशन ऊतक में फाइब्रोब्लास्ट संश्लेषण और जमा कोलेजन शुरू होते हैं। नए मैट्रिक्स का रीमॉडलिंग और संगठन चोट के बाद 1 साल तक चल सकता है³। कई सेल प्रकारों के बीच क्रॉस-टॉक से जुड़ी ओवरलैपिंग घटनाओं की जटिलता के कारण, और अनुसंधान के वर्षों के बावजूद, घाव भरने में अंतर्निहित कई सेलुलर और आणविक तंत्र खराब समझ में आते हैं।

माउस मॉडल उनके उपयोग में आसानी, अपेक्षाकृत कम लागत और आनुवंशिकमणिपुलेबिलिटी^1,4,5के कारण घाव भरने के तंत्र की जांच करने के लिए प्रमुख स्तनधारी मॉडल है। यद्यपि मुरीन मॉडल में विभिन्न प्रकार के घावों का वर्णन किया गया है, लेकिन सबसे आम एक छिद्रिक घाव (या तो द्विपक्षीय पंच या प्रत्यक्ष पंच बायोप्सी) है, जिसके बाद चीरा घाव मॉडल⁴है। चीरा घाव मॉडल चीरा मॉडल पर एक अलग लाभ है क्योंकि यह स्वाभाविक रूप से नियंत्रण ऊतक है कि चिकित्सा प्रक्रिया से गुजरना नहीं पड़ा है उत्पन्न करता है । पंच बायोप्सी ऊतक है कि शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल के भाग के रूप में उत्पादित है घायल ऊतक के रूप में एक ही तरीके से संसाधित किया जा सकता है और एक वांछित कसौटी के लिए homeostatic शर्तों को स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया । यदि त्वचा के पूर्व उपचार के प्रभावों का आकलन करना या चोट के समय सफल जीन परिवर्तन की पुष्टि करना^{हो तो}उत्पादित नियंत्रण ऊतक भी उपयोगी हो सकते हैं ।

हीलिंग पैरामीटर्स का आकलन कई अलग-अलग तकनीकों द्वारा किया जा सकता है, जिसमें प्लैनिमेट्री या हिस्टोरोलॉजी शामिल हैं। हालांकि, प्लैनिमेट्री केवल घाव की दृश्यमान विशेषताओं का मूल्यांकन कर सकता है, और एक पपड़ी की उपस्थिति के कारण, अक्सर हिस्टोलॉजी द्वारा कल्पना किए गए उपचार के माप से संबंधित नहीं होता है, जिससे हिस्ट्रोलॉजी विश्लेषण 4 का “स्वर्ण मानक” बन^जाताहै। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण सोने के मानक होने के बावजूद, यह अक्सर घाव^{6, 7}के मनमाने सबसेट पर किया^जाताहै। उदाहरण के लिए, घाव को एम्बेड करने और खंडित करने से पहले “आधा” में घाव को काटना वर्तमान में सामग्री और डेटा विश्लेषण की धारा पर खर्च किए गए समय और संसाधनों को कम करने के लिए आम प्रथा है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित रूपांतर विश्लेषण की विधि को पूरे घाव ऊतक को शामिल करने, घाव की रूपात्मक विशेषताओं को सही ढंग से प्रतिबिंबित करने और एक छोटे प्रभाव आकार के साथ घाव उपचार दोषों का पता लगाने की संभावना को बढ़ाने के लिए विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, हम सबसे अधिक अध्ययन किए गए मुरीन घाव, द्विपक्षीय पूर्ण मोटाई के उत्तेजना घाव, साथ ही हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक विस्तृत और कठोर विधि पैदा करने के लिए एक शल्य चिकित्सा विधि का विस्तार करते हैं, जैसे कि क्षेत्र में शायद ही कभी उपयोग किया जाता है।

Protocol

सभी प्रयोगों के अनुसार और संघीय नियमों और आयोवा नीति और प्रक्रियाओं के विश्वविद्यालय के अनुपालन में पूरा किया गया आयोवा IACUC विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है । 1. पशु और पशुपालन 8-10…

Representative Results

चित्र 5 में कई सर्जनों द्वारा विभिन्न माउस उपभेदों में उत्पन्न जंगली प्रकार के घावों पर मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण करके प्राप्त मापा और गणना मूल्यों में सीमा को दर्शाया गया है और विभिन्न व्यक?…

Discussion

द्विपक्षीय एक्सीसिओनल घाव मॉडल एक अत्यधिक अनुकूलन प्रक्रिया है जिसका उपयोग घाव भरने के कई अलग-अलग पहलुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। घाव भरने की परियोजना शुरू करने से पहले, जांचकर्ताओं को ए?…

Materials

100% ethanol
70% ethanol
80% ethanol
95% ethanol
Alcohol Prep	NOVAPLUS	V9100	70% Isopropyl alcohol, sterile
Ammonium hydroxide
Biopsy pads	Cellpath	22-222-012
Black plastic sheet			Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper
Brightfield microscope			With digital acquisition capabilities and a 4X objective
Cotton tipped applicators
Coverslips			22 x 60 #1
Dental wax sheets
Digital camera			Include a ruler for scale, if applicable
Dissection teasing needle (straight)
Embedding molds			22 x 22 x 12
Embedding rings	Simport Scientific Inc.	M460
Eosin Y
Glacial acetic acid
Hair clipper
Heating pad	Conair		Moist dry Heating Pad
Hematoxylin
Microtome
Microtome blades
Paint brushes
Paraffin Type 6
Paraformaldehyde
Permount
Phosphate buffer solution (PBS)
Povidone-iodine	Aplicare	82-255
Processing cassette	Simport Scientific Inc.	M490-2
Razor blades	ASR		.009 Regular Duty
Scalpel blades #10
Scalpel handle
Sharp surgical scissors			sterile for surgery
Skin biopsy punches			Size as determined by researcher
Slide boxes
Slide warmers
Superfrosted microscope slides	Fisher Scientific	22 037 246
Temperature control water bath
Tissue embedding station			Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate
Tissue processor			Minimum of a oven with a vacuum pump
Triple antibiotic opthalmic ointment
tweezers, curved tip			sterile for surgery
tweezers, tapered tip			sterile for surgery
WypAll X60	Kimberly-Clark	34865