Modelo de cura da ferida excisional de Murine e Análise de Ferida Morfômica Histológica
Summary
Este protocolo descreve como gerar feridas excisionais bilaterais e de espessura total em camundongos e como monitorar, colher e preparar as feridas para análise morfométrica. Incluído é uma descrição aprofundada de como usar seções histológicas seriais para definir, quantificar e detectar defeitos morfométricos.
Abstract
O modelo de ferida excisional de murina tem sido usado extensivamente para estudar cada uma das fases sequencialmente sobrepostas da cicatrização da ferida: inflamação, proliferação e remodelação. As feridas de Murina têm um leito de ferida histologicamente bem definido e facilmente reconhecível sobre o qual essas diferentes fases do processo de cura são mensuráveis. Dentro do campo, é comum o uso de um “meio” arbitrariamente definido da ferida para análises histológicas. No entanto, as feridas são uma entidade tridimensional e muitas vezes não histologicamente simétrica, apoiando a necessidade de um método bem definido e robusto de quantificação para detectar defeitos morfométricos com um pequeno tamanho de efeito. Neste protocolo, descrevemos o procedimento para a criação de feridas excisionais bilaterais e de espessura total em camundongos, bem como uma instrução detalhada sobre como medir parâmetros morfométricos usando um programa de processamento de imagem em seções seriais selecionadas. As medidas de duas dimensões do comprimento da ferida, comprimento epidérmico, área epidérmica e área da ferida são usadas em combinação com a distância conhecida entre as seções para extrapolar a área epidérmica de três dimensões que cobre a ferida, área geral da ferida, volume epidérmico e volume da ferida. Embora esta análise histológica detalhada seja mais demora e recursos do que as análises convencionais, seu rigor aumenta a probabilidade de detectar novos fenótipos em um processo de cicatrização de feridas inerentemente complexo.
Introduction
A cicatrização de feridas cutâneas é um processo biológico complexo com fases sequencialmente sobrepostas. Requer a coordenação de processos celulares e moleculares que são regulados temporal e espacialmente para restaurar a função de barreira do epitélio danificado. Na primeira fase, inflamações, neutrófilos e macrófagos migram para a ferida, mobilizando defesas locais e sistêmicas1. Seguir e sobrepor a fase inflamatória é o estágio de proliferação. Os fibroblastos começam a proliferar rapidamente e migrar para o tecido de granulação. Os queratinócitos para longe da borda principal proliferam direcionalmente em direção à ferida à medida que queratinócitos diferenciados na borda principal migram para re-epitelializar a ferida2. Finalmente, começa a fase de remodelação e maturação, durante a qual os fibroblastos no tecido de granulação começam a sintetizar e depositar colágeno. A remodelagem e organização da nova matriz pode durar até 1 ano após a lesão3. Devido à complexidade dos eventos sobrepostos envolvendo conversas cruzadas entre múltiplos tipos celulares, e apesar de anos de pesquisa, muitos dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à cicatrização das feridas permanecem mal compreendidos.
O modelo de camundongos é o modelo predominante de mamíferos para investigar mecanismos de cicatrização de feridas devido à sua facilidade de uso, custo relativamente baixo e manipulabilidade genética1,4,5. Embora diferentes tipos de feridas tenham sido descritas no modelo murino, o mais comum é uma ferida excisional (seja um soco bilateral ou biópsia direta do soco), seguida pelos modelos de ferida incisional4. O modelo de ferida excisional tem uma vantagem distinta sobre o modelo incisional, pois inerentemente gera tecido de controle que não passou pelo processo de cicatrização. O tecido de biópsia de soco excisado como parte do protocolo cirúrgico pode ser processado da mesma forma que o tecido ferido e usado para estabelecer as condições homeostáticas para um critério desejado. O tecido de controle excisado também pode ser útil se avaliar os efeitos de um pré-tratamento da pele ou confirmar alteração genética bem sucedida no momento da lesão4.
Os parâmetros de cura podem ser avaliados por muitas técnicas diferentes, incluindo planimetria ou histologia. No entanto, a planimetria só pode avaliar características visíveis da ferida, e devido à presença de uma cicatriz, muitas vezes não se correlaciona com medidas de cura que são visualizadas pela histologia, tornando a histologia o “padrão-ouro” da análise4. Apesar da análise histológica ser o padrão-ouro, é mais frequentemente realizada em um subconjunto arbitrário da ferida6,7. Por exemplo, cortar a ferida em “metade” antes de incorporar e seccionar a ferida é a prática comum para reduzir o tempo e os recursos gastos na seção de materiais e análise de dados. O método de análise morfométrica descrito neste protocolo foi desenvolvido para abranger todo o tecido da ferida, para refletir com precisão as características morfológicas da ferida, e para aumentar a probabilidade de detectar defeitos de cicatrização de feridas com um pequeno tamanho de efeito. Neste protocolo, detalhamos um método cirúrgico para a geração da ferida murina mais estudada, a ferida excisional de espessura total bilateral, bem como um método detalhado e rigoroso para análise histológica, como raramente é utilizado no campo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O modelo bilateral de ferida excisional é um procedimento altamente personalizável que pode ser usado para estudar muitos aspectos diferentes da cicatrização de feridas. Antes de iniciar um projeto de cicatrização de feridas, os investigadores devem realizar uma análise de energia para determinar o número de feridas necessárias para detectar um defeito de um determinado tamanho de efeito. Existem inconsistências na literatura sobre se camundongos individuais ou feridas devem ser usados como réplicas biológica…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a todos os membros do Laboratório Dunnwald que contribuíram para a otimização deste protocolo ao longo dos anos, e a Gina Schatteman cuja persistência em promover o uso de seção serial para análise de feridas tornou sua criação possível. Este trabalho foi apoiado por financiamento do NIH/NIAMS para Martine Dunnwald (AR067739).
Materials
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
Riferimenti
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
