פרוטוקול זה מציג שיטה להדמיית פעילות אוכלוסיה עצבית עם רזולוציה של תא יחיד במינים לא מהונדסים של חוליות באמצעות צבעים רגישים למתח ספיגה ומערך פוטודיודות. גישה זו מאפשרת זרימת עבודה מהירה, שבה ניתן לבצע הדמיה וניתוח במהלך יום אחד.
התפתחות של תכשירים מהונדסים ללא חוליות שבהן ניתן להקליט את הפעילות של קבוצות של נוירונים הניתנים לתמרון עם אור מייצג התקדמות מהפכנית למחקרים של הבסיס העצבי של ההתנהגות. עם זאת, החיסרון של התפתחות זו הוא נטייתה למקד את החוקרים במספר קטן מאוד של אורגניזמים “מעצבים” (למשל, C. elegans ו Drosophila), פוטנציאל להשפיע לרעה על המרדף אחר מחקרים השוואתיים על פני מינים רבים, אשר נדרש לזיהוי עקרונות כלליים של תפקוד הרשת. המאמר הנוכחי ממחיש כיצד הקלטה אופטית עם צבעים רגישים למתח במוחם של מינים גסטרופודיים שאינם מהונדסים יכולה לשמש במהירות (כלומר, במהלך ניסויים בודדים) לחשוף תכונות של הארגון הפונקציונלי של הרשתות העצביות שלהם עם רזולוציה של תא אחד. אנו מתארים בפירוט את שיטות הניתוח, הכתמים וההקלטה המשמשות את המעבדה שלנו כדי להשיג עקבות פוטנציאליים לפעולה מעשרות עד ~ 150 נוירונים במהלך תוכניות מוטוריות רלוונטיות מבחינה התנהגותית במערכת ן של מינים גסטרופוד מרובים, כולל אחד חדש למדעי המוח – nudibranch ברגיה סטפניאה. ההדמיה מתבצעת עם צבעים רגישים למתח ספיגה ומערך פוטודיודה של 464 אלמנטים שדוגם במהירות של 1,600 פריימים לשנייה, מהר מספיק כדי ללכוד את כל פוטנציאל הפעולה שנוצר על ידי הנוירונים המוקלטים. הקלטות מרובות של מספר דקות ניתן להשיג לכל הכנה עם מעט מאוד אות הלבנת או פוטוטוקסיה. הנתונים האופטיים הגולמיים שנאספו בשיטות המתוארות ניתן לנתח לאחר מכן באמצעות מגוון שיטות מאוירות. ניתן להשתמש בגישה האופטית שלנו לבדיקת פעילות הרשת במגוון מינים לא מהונדסים, מה שהופך אותה להתאמה היטב למחקרים השוואתיים על האופן שבו המוחות מייצרים התנהגות.
הפיתוח של קווים מהונדסים של חסרי חוליות כגון Drosophila ו- C. elegans סיפק מערכות חזקות שבהן הבסיסים העצביים של התנהגות עשויים להיחקר אופטית מניפולציה. עם זאת, תכשירים מיוחדים אלה עשויים להיות החיסרון של הפחתת ההתלהבות למחקרי מעגל עצבי של מינים לא מהונדסים, במיוחד לגבי כניסת מינים חדשים למחקר מדעי המוח. התמקדות אך ורק במערכת מודל אחת או שתיים מזיקה לחיפוש אחר עקרונות כלליים של פונקציית הרשת, מכיוון שמחקרים השוואתיים מייצגים מסלול חיוני שבאמצעותו מתגלים עקרונות כאלה1,2,3,4. המטרה שלנו כאן היא להדגים גישה הדמיה בקנה מידה גדול לקבלת תובנה מהירה לתוך המבנה הפונקציונלי של רשתות עצביות gastropod, במאמץ להקל על מחקרים השוואתיים של תפקוד הרשת העצבית.
רכיכות גסטרופוד כגון אפליה, לימנאה, טריטוניה, Pleurobranchaea ואחרים שימשו זמן רב כדי לחקור עקרונות של תפקוד הרשת העצבית, במידה רבה משום שההתנהגויות שלהם מתווכות על ידי נוירונים גדולים, לעתים קרובות לזיהוי אישי הממוקמים על פני השטח של הגרעינים, מהשהופךאותם נגישים בקלות לטכניקות הקלטה 5 . בשנות ה-70 פותחו צבעים רגישים למתח (VSDs) שיכולים להשתלב בקרום הפלזמה, אשר אפשרו עד מהרה את ההקלטות הראשונות ללא אלקטרודה של פוטנציאל הפעולה שנוצר על ידי נוירונים מרובים6. כאן, אנו מדגימים את השימוש שלנו VSDs כדי לבחון את פעילות הרשת במספר מינים של גסטרופודים, כולל אחד חדש למדעי המוח, ברגיה סטפניאה. מכשיר ההדמיה הוא מערך פוטודיודה (PDA) זמין מסחרית של 464 אלמנטים, אשר מדגם ב-1,600 פריימים לשנייה (איור 1),אשר, כאשר משתמשים בו עם VSDs לספיגה מהירה, חושף את פוטנציאל הפעולה של כל הנוירונים המוקלטים7. האותות שנרשמו על ידי כל הדיודות מוצגים מיד לאחר הרכישה ומונחים על גבי תמונה של הגנגליון בתוכנת רכישת מחשב כף היד, מה שמאפשר לחקור נוירונים מעניינים עם אלקטרודות חדות באותה הכנה8,9.
בנתוני מחשב כף היד הגולמיים, דיודות רבות מתעדות באופן יתיר את הנוירונים הגדולים יותר, ורבות מהן מכילות גם אותות מעורבים מתאי עצב מרובים. נקודת מפנה הייתה פיתוח של שיטת מיון ספייק אוטומטית באמצעות ניתוח רכיבים עצמאי כדי לעבד במהירות כל ערכת נתוני PDA גולמיים של 464 ערוצים לתוך קבוצה חדשה של עקבות, שבה כל נוירון מוקלט מופיע בעקבות נפרדים המכילים רק את פוטנציאל הפעולה שלו10,11.
במאמר זה אנו מתארים את הצעדים החיוניים הכרוכים בהשגת הקלטות פוטנציאליות לפעולה בקנה מידה גדול ממערכות העצבים גסטרופוד עם מערך פוטודיודה ו VSDs ספיגה מהירה. יתר על כן, אנו ממחישים שיטות אנליטיות שניתן להשתמש בהן לאשכולות ומיפוי הנוירונים המתועדים אופטית ביחס להרכבים התפקודיים שלהם, ולאפיון תכונות ברמת האוכלוסייה שלעתים קרובות אינן נראות לעין באמצעות בדיקה פשוטה של עקבות הירי12,13.
אחד הפרטים החשובים ביותר ביישום גישת הדמיית VSD בקנה מידה גדול שלנו הוא למזער רטט, אשר מייצר תנועות של קצוות ניגודיות על פני הדיודות, וכתוצאה מכך אותות חפצים גדולים. מכיוון ש-VSDs של ספיגה מייצרים שינויים באחוזים קטנים מאוד בעוצמת האור עם פוטנציאל פעולה, ממצאי רטט, אם לא נמנעים, יכולים לטשטש את אותות העניין העצביים. אנו משתמשים במספר שיטות כדי למזער חפצי רטט. ראשית, חדר ההדמיה שלנו ממוקם בקומת הקרקע, אשר מבודד את ההכנה מרעידות הקשורות לבניית ציוד לטיפול באוויר ומקורות רבים אחרים. שנית, נעשה שימוש בטבלת בידוד מבוססת קפיץ, אשר משתמשי PDA אחרים אישרו מספקת שיכוך רטט טוב יותר מאשר שולחן האוויר הנפוץ יותר16. שלישית, נעשה שימוש במטרות טבילת מים, אשר מבטלות תנודות תמונה הנובעות מאדוות פני השטח. רביעית, ההכנה המצולמת נלחצה קלות בין מכסה התא התחתון לבין שבר כיסוי לחוץ מלמעלה המוחזק במקום על ידי תקעים סיליקון או ג’לי נפט, עוד יותר מייצב את ההכנה. זה גם משטח את פני השטח הקומורים של הגנגליון או הגרעינים להיות בתמונה, וכתוצאה מכך נוירונים יותר במישור של המוקד של המטרה, אשר מגדיל את מספר הנוירונים שתועדו.
כדי למקסם את יחס האות לרעש עבור השינויים הקטנים מאוד במידת ספיגת אור VSD הנובעים מפוטנציאל פעולה, חיוני להשיג אור כמעט רווי באמצעות ההכנה ל- PDA, ובמקביל למזער את ההלבנה של הצבע. כדי לכך, אנו עובדים בדרך כלל ב 3-4 V של עוצמת אור במנוחה, כפי שנמדד עם מתג רווח לוח הבקרה של מחשב כף היד במיקום 1x (464 המגברים של מחשב כף היד רוויים ב 10 V של אור). במהלך רכישת נתונים גורם רווח זה משתנה ל- 100x. קבלת מספיק אור כדי להגיע 3-4 V כפי שנמדד על ידי מחשב כף היד יכול להתבצע במספר דרכים. ראשית, השתמש במקור תאורת LED אולטרה-רייט המספק אורך גל המתאים למאפייני הספיגה של צבע הספיגה בשימוש. בהתאם לכך, נעשה שימוש במנורה קולימת LED 735-nm, החופפת לאורכי הגל האופטימליים של RH155 ו- RH482. שנית, במידת הצורך, השתמש במכנס תת-הבמה ההפוך שמרכז את האור ממקור תאורת ה-LED לאזור קטן יותר. שלישית, כווננו את גובה המעיבוי כדי להשיג תאורת קולר, המבטיקה בהירות גבוהה, אפילו לאיכות תמונה מרבית. רביעית, ודא שאין מסנני חום במסלול האופטי, שיכולים להחליק את אורך הגל של מנורת ה- LED 735 ננומטר. חמישית, להסיר מפזר, אם יש צורך יותר אור, מן המסלול האופטי. שישית, השתמש במטרות NA גבוהות, המספקות רזולוציה מרחבית גבוהה, ומאפשרות רמות מספיקות של אור כדי להגיע מחשב כף היד בעוצמות מנורה נמוכות יותר. זה איפשר לנו למזער את ההלבנה עד כדי כך שנוכל להשיג מספר קבצי רכישה של משך של 10-20 דקות לכל הכנה באמצעות אותה עוצמת אור בכל הקבצים וללא אובדן משמעותי של משרעת האות או הצורך בהכתמה מחדש. באופן מכריע, אם הנסיין רוצה לעקוב אחר נוירונים על פני קבצים ארוכים אלה, להבטיח כי מישור המוקד אינו משתנה, וכי ההכנה אינה זזה. לבסוף, דרך נוספת לנתב מספיק אור אל מחשב כף היד היא להשתמש בבעלי חיים צעירים יותר, שיש להם גרעים דקים יותר, ולכן פחות אטומים.
מעת לעת אנו מוצאים כי יחס האות לרעש של האותות האופטיים מתדרדר ו / או מקצבי תוכנית המנוע הם תת-אופטימליים (למשל, איטיים או לא תקינים). כאשר זה מתחיל להתרחש באופן עקבי, אנו מערבבים פתרונות טריים של VSD. Aliquots של VSD בדרך כלל להישאר קיימא במשך כ 6 חודשים במקפיא -20 °C .. בהקשר זה, ראוי לציין כי עבור ברגיה, התוצאות הטובות ביותר הושגו עד כה עם ספיגה VSD RH482. כמו RH482 הוא ליפופילי יותר מאשר RH155, זה עשוי להכתים טוב יותר את הנוירונים הקטנים יחסית של ברגיה או להישאר בממברנות העצביות בצורה יעילה יותר בטמפרטורת המלח הקלטה גבוהה יותר המשמשת למין טרופיזה.
מגבלה אחת של הדמיה מבוססת PDA של פעילות עצבית מתייחסת צימוד AC של אותות המתח בחומרה לפני שלב ההפללה מראש 100x: למרות שזה מייצג תכונה הכרחית כדי להסיר את היסט DC הגדול המיוצר על ידי רמת האור במנוחה גבוהה הנדרשת על ידי טכניקה זו, צימוד AC מהותי PDA מונע את מדידת שינויים איטיים בפוטנציאל הממברנה, כגון אלה המשויכים לכניסות סינפטיות. אם יש צורך בהקלטת שינויים פוטנציאליים איטיים או יציבים, ניתן להשתמש במערכת הדמיית מצלמות CMOS מצמיד DC כדי ללכוד פעילות תת-קרקעית. ביירן ועמיתיו השתמשו לאחרונה במערך כזה עם RH155 כדי לדמיין את הפעילות של נוירונים בגנגליון buccal של אפלזיה17,18. השתמשנו בשתי המערכות ומצאנו כי מצלמת CMOS, בשל צפיפות הגלאים הגבוהה בהרבה שלה (128 x 128), מייצרת קבצי נתונים גדולים פי 50 לאותו זמן הדמיה7. הקבצים הקטנים יותר של מחשב כף היד מאפשרים עיבוד וניתוח מהירים יותר. זה גם מאפשר הקלטות ניסיון יחיד מורחבות (איור 4) ומחקרים של למידה, שבהם נתונים מניסויים מרובים ממוסמרים לקובץ אחד גדול לפני מיון ספייק, ומאפשר ארגון רשת להיות במעקב כמולמידה מתפתחת 19.
בחקירות אחרות המבוססות על מצלמה, VSDs פלואורסצנטי שימשו את קריסטן ועמיתיו כדי לבחון את תפקוד הרשת בגרעינים המגזריים של העלוקה. במחקר משפיע אחד זה הוביל לזיהוי של נוירון המעורב בהחלטה של החיה לשחות או לזחול20. במחקר אחר, קריסטן ואח ‘ בחנו את המידה שבה התנהגויות השחייה והזחילה של העלוקה מונעות על ידי מעגלים רב תכליתיים לעומת מעגלים ייעודיים21. לאחרונה, Wagenaar ועמיתיו השתמשו במיקרוסקופ דו-צדדי להדמיית מתח המאפשר להם להקליט כמעט מכל הנוירונים בגנגליון מגזרי עלוקה22. בניגוד לשיטות הדמיה רבות המבוססות על מצלמה, יתרון שיטת ההדמיה מבוססת ה-PDA שלנו הוא מיון ספייק מהיר ובלתי משוחד על ידי ICA, צורה של הפרדת מקור עיוורת שלא כוללת החלטות לגבי גבולות עצביים לעיבוד תוצאות.
לגבי הבחירה של VSDs, יתרון אחד של צבעי הספיגה RH155 ו RH482 הוא פוטוטוקסיה קטנה עד לא הקשורה אליהם23,24, המאפשר זמני הקלטה ארוכים יותר מהרגיל עבור VSDscent פלואורסצנטי. יתר על כן, VSDs ספיגה מהירה אנו משתמשים מתאימים היטב להקלטת פוטנציאל פעולה סומטית overshooting בתכשירי גסטרופוד, שהם בדרך כלל 80 mV משרעת. כפי שמוצג באיור 3G, השיטה האופטית שלנו יכולה לתעד חבטות פוטנציאליות לפעולה (אף אחת מההקלטות שלנו אינה ממוצעת מעקב): הדבר מצביע על כך שה-VSDs שאנו משתמשים בהם אמורים להיות מסוגלים להבחין בפוטנציאל פעולה במערכות מודל אחרות שמחליפות במידה מסוימת ולכן אינן מגזימות עד שהן מגיעות לסומה. עם זאת, הגישה האופטית שלנו לא יכול להיות אידיאלי עבור מינים הידועים להפגין פוטנציאל פעולה מופחת מאוד כאשר נרשם סומה.
מחקר עדכני רב על רשתות עצביות מתמקד במספר קטן של מינים מהונדסים מעצב. עם זאת, מדעי המוח נהנים ממחקר של מגוון רחב של מינים שונים מבחינה פילוגנטית. חקר מינים רבים ושונים מספק תובנות על האופן שבו מעגלים מתפתחים25,26, ומאיר עקרונות של תפקוד הרשת שעשויים להיות נפוצים על פני פילה1,2,3,4,27. עד כה יישמנו את שיטת ההדמיה שלנו על מספר מינים של גסטרופודים, כולל אפליה קליפורניקה8,11,12,13,14,28, טריטוניה דיומדאה8,9,11,14,19,28, טריטוניה פסטיבה28, Pleurobranchaea californica (נתונים שלא פורסמו), ולאחרונה ברגיה סטפניאה (איור 5). ערעור של גישה זו הוא כי זה יכול להיות מיושם בקלות על מינים רבים, ללא צורך בבעלי חיים מהונדסים. אנו רוצים להכיר בכך שהשימוש שלנו בהדמיית VSD עם צבעי ספיגה מהירה ו- PDA הולך בעקבות עבודה חלוצית שהשיגה זאת בהכנות נבאנקס29 ואפילזיה30. הדגש שלנו על מהירות הגישה שלנו הוא בחלקו תשובה לחששות כי חוקרים רבים עשויים להיות יותר ויותר מסרבים ליזום מחקרי רשת במינים חדשים בשל חשש כי שנים של מחקר יהיה צורך לאפיין ארגון רשת בסיסי לפני שיוכלו לחקור שאלות מדעיות עניין רחב למדעי המוח31. בהתאם לכך, המטרה שלנו כאן היא להדגים טכניקה שמזרזת מאוד את התהליך – עד כדי כך שניתן לקבל תובנות משמעותיות באותו יום על ארגון הרשת מהכנות בודדות.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי NSF 1257923 ו- NIH 1U01NS10837. המחברים מבקשים להכיר בסיועו של ז’אן וונג במעבדה.
Achromat 0.9 NA swing condenser | Nikon | N/A | |
Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 with SC-20 | Controls perfusion saline temperature |
Chamber thermometer | Physitemp | BAT-12 with IT-18 microprobe | |
Digital camera | Optronics | S97808 | |
Dissecting forceps | Dumont | #5 | |
Dissecting scissors | American Diagnostic Corp. | ADC-3410Q | |
Imaging microscope | Olympus | BX51WIF | |
Imaging perfusion chamber | Siskiyou | PC-H | |
Instant Ocean | Instant Ocean | SS6-25 | Makes 25 gallons at a time |
Master-8 pulse stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
Microdispenser | Drummond Scientific | 3-000-752 | Dye applicator for pressure staining |
Microdissection scissors | Moria | 15371-92 | |
Minutien pins (0.1 mm) | Fine Science Tools | NC9677548 | For positioning and stabilizing CNS |
Motorized microscope platform | Thorlabs | GHB-BX | Gibraltar platform |
NeuroPlex imaging software | RedShirtImaging | NeuroPlex | Compatible with the WuTech photodiode array |
Objective lenses | Olympus | XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340 | |
PE-100 polyethylene tubing | VWR | 63018-726 | Tubing to make suction electrodes |
Perfusion pump | Instech | P720 with DBS062SDBSU tube set | |
Petroleum jelly | Equate | NDC 49035-038-54 | |
Photodiode array with control panel | WuTech Instruments | 469-IV photodiode array | Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information |
RH155 | Santa Cruz Biotechnology | sc-499432 | Voltage-sensitive dye |
RH482 | Univ of Conn. Health Center | JPW-1132 | Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow |
Silicone earplugs | Mack's | Model 7 | To be use for preparation compression |
Staining PE tubing | VWR | 63018-xxx | Different sizes depending on fit |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
Thorlabs LED and driver | Thorlabs | M735L2-C1, DC2100 | LED lamp and driver |
Tygon tubing | Fisher Scientific | 14-171-xxx | |
Vibration isolation table | Kinetic Systems | MK26 | Spring-based |