Detta protokoll presenterar en metod för avbildning neuronal befolkning verksamhet med encellig upplösning i icke-transgena ryggradslösa arter med hjälp av absorbans spänning känsliga färgämnen och en fotodiod array. Detta tillvägagångssätt möjliggör ett snabbt arbetsflöde, där avbildning och analys kan bedrivas under en enda dag.
Utvecklingen av transgena ryggradslösa preparat där aktiviteten hos specifika uppsättningar av nervceller kan registreras och manipuleras med ljus representerar ett revolutionerande framsteg för studier av den neurala grunden för beteende. En nackdel med denna utveckling är dock dess tendens att fokusera utredare på ett mycket litet antal “designer” organismer (t.ex. C. elegans och Drosophila), vilket potentiellt negativt påverkar strävan efter jämförande studier över många arter, vilket behövs för att identifiera allmänna principer för nätverksfunktion. Den nuvarande artikeln illustrerar hur optisk inspelning med spänningskänsliga färgämnen i hjärnan hos icke-transgena snäckor kan användas för att snabbt (dvs. inom tiden för enstaka experiment) avslöja funktioner i funktionell organisation av deras neurala nätverk med encellsupplösning. Vi beskriver i detalj dissekerings-, färgnings- och inspelningsmetoderna som används av vårt laboratorium för att få åtgärdspotentialspår från dussintals till ~ 150 neuroner under beteenderelevanta motorprogram i CNS av flera snäckor, inklusive en ny till neurovetenskap – nudibranch Berghia stephanieae. Avbildning utförs med absorbansspänningskänsliga färgämnen och en 464-element fotodiodmatris som provtar vid 1 600 bilder / sekund, tillräckligt snabbt för att fånga alla åtgärdspotentialer som genereras av de registrerade nervcellerna. Flera flera minuters inspelningar kan erhållas per beredning med liten eller ingen signalblekning eller fototoxicitet. De obehandlade optiska data som samlas in genom de beskrivna metoderna kan därefter analyseras med hjälp av en mängd olika illustrerade metoder. Vår optiska inspelningsmetod kan lätt användas för att undersöka nätverksaktivitet i en mängd icke-transgena arter, vilket gör den väl lämpad för jämförande studier av hur hjärnor genererar beteende.
Utvecklingen av transgena linjer av ryggradslösa djur som Drosophila och C. elegans har gett kraftfulla system där de neurala grunderna för beteende kan förhöras optiskt och manipuleras. Dessa speciella preparat kan dock ha nackdelen att minska entusiasmen för neurala kretsstudier av icke-transgena arter, särskilt när det gäller införandet av nya arter i neurovetenskaplig forskning. Att fokusera uteslutande på ett eller två modellsystem är skadligt för sökandet efter allmänna principer för nätverksfunktion, eftersom jämförande studier representerar en viktig väg genom vilken sådana principerupptäcks 1,2,3,4. Vårt mål här är att demonstrera en storskalig bildbehandlingsmetod för att få snabb inblick i den funktionella strukturen hos gastropod neurala nätverk, i ett försök att underlätta jämförande studier av neural nätverksfunktion.
Snäckor och andra har länge använts för att undersöka principer för neural nätverksfunktion, till stor del på grund av att deras beteenden förmedlas av stora, ofta individuellt identifierbara nervceller som ligger på gangliernas yta, vilket gör dem lättillgängliga för inspelningstekniker5. På 1970-talet utvecklades spänningskänsliga färgämnen (VSD) som kan integreras i plasmamembranet som snart möjliggjorde de första elektrodfria inspelningarna av de åtgärdspotentialer som genererades av flera nervceller6. Här demonstrerar vi vår användning av VSDs för att undersöka nätverksaktivitet i flera arter av snäckor, inklusive en ny till neurovetenskap, Berghia stephanieae. Bildbehandlingsenheten är en kommersiellt tillgänglig 464-elements fotodiodmatris (PDA) som provar vid 1 600 bilder/sekund (figur 1), som, när den används med vsd-enheter med snabb absorbans, avslöjar åtgärdspotentialerna hos alla registrerade nervceller7. Signalerna som registreras av alla dioder visas omedelbart efter förvärvet och läggs ovanpå en bild av ganglion i PDA-förvärvsprogramvaran, vilket gör det möjligt att undersöka nervceller av intresse med skarpa elektroder i sammaförberedelse 8,9.
I de råa PDA-data registrerar många dioder redundant de större nervcellerna, och många innehåller också blandade signaler från flera nervceller. En vändpunkt var utvecklingen av en automatiserad spiksorteringsmetod med oberoende komponentanalys för att snabbt bearbeta varje rå 464-kanalig PDA-datauppsättning till en ny uppsättning spår, där varje inspelad neuron visas i ett separat spår som bara innehåller dess åtgärdspotentialer10,11.
I den här artikeln beskriver vi de väsentliga stegen som är involverade i att få storskaliga action potentiella inspelningar från snäckorv nervsystemet med en fotodiod array och snabb absorbans VSDs. Vi illustrerar dessutom analytiska metoder som kan användas för att gruppera och kartlägga de optiskt inspelade nervcellerna med avseende på deras funktionella ensembler och för att karakterisera funktioner på befolkningsnivå som ofta inte är uppenbara genom enkel inspektion av avfyrningsspåren12,13.
En av de viktigaste detaljerna i implementeringen av vår storskaliga VSD-bildbehandling är att minimera vibrationer, vilket ger rörelser av kontrastkanter över dioderna, vilket resulterar i stora artefaktsignaler. Eftersom absorbans VSD producerar mycket små procentuella förändringar i ljusintensitet med åtgärdspotentialer, kan vibrationsartefakter, om de inte förhindras, skymma de neuronala signalerna av intresse. Vi använder flera metoder för att minimera vibrationsartefakter. För det första ligger vårt bildrum på bottenvåningen, vilket isolerar preparatet från vibrationer relaterade till att bygga luftbehandlingsutrustning och många andra källor. För det andra användes en fjäderbaserad isoleringstabell, som andra handdatoranvändare har bekräftat ger bättre vibrationsdämpning än det vanligare luftbordet16. För det tredje användes mål för vattensänkning, vilket eliminerar bildfluktuationer som härrör från ytktueringar. För det fjärde trycktes preparatet lätt mellan kammarens täckstäppbotten och ett täcksplitter som trycktes ner ovanifrån och som hålls på plats av silikonpluggar eller petroleumgel, vilket ytterligare stabiliserar preparatet. Detta plattar också ut konvexytan av ganglion eller ganglier som avbildas, vilket resulterar i fler nervceller i målets fokusplan, vilket ökar antalet registrerade nervceller.
För att maximera signal-till-brus-förhållandet för de mycket små förändringarna i graden av VSD-ljusabsorbans till följd av en åtgärdspotential är det viktigt att uppnå nästan mättande ljus genom beredningen till handdatorn, samtidigt som man minimerar fotoblekningen av färgämnet. För detta ändamål arbetar vi vanligtvis med 3-4 V viloljusintensitet, mätt med PDA-kontrollpanelens förstärkningsbrytare i 1x-läge (handdatorns 464 förstärkare mättar vid 10 V ljus). Vid datainsamling ändras denna förstärkningsfaktor till 100x. Att få tillräckligt med ljus för att nå 3-4 V mätt med handdatorn kan uppnås på flera sätt. Använd först en ultrabright LED-ljuskälla som ger en våglängd som är lämplig för absorptionsegenskaperna hos absorbansfärgen som används. Följaktligen användes en 735 nm LED-kollimerad lampa, som överlappar de optimala absorptionsvåglängderna RH155 och RH482. För det andra, använd vid behov en flip-top understegskondensator som koncentrerar ljuset från LED-ljuskällan till ett mindre område. För det tredje justerar du kondensorhöjden för att uppnå Köhler-belysning, vilket säkerställer hög, jämn ljusstyrka och maximal bildkvalitet. För det fjärde, se till att det inte finns några värmefilter i den optiska vägen, vilket kan dämpa LED-lampans 735 nm våglängd. För det femte, ta bort diffusorer, om mer ljus behövs, från den optiska vägen. För det sjätte, använd höga NA-mål, som ger hög rumslig upplösning, och gör det möjligt för tillräckligt med ljusnivåer för att nå handdatorn vid lägre lampintensiteter. Detta har gjort det möjligt för oss att minimera fotoblekning i den utsträckning som vi kan få flera förvärvsfiler på 10-20 min varaktighet per förberedelse med samma ljusintensitet över alla filer och utan en betydande förlust av signalamlitud eller behovet av omfärgning. Avgörande, om experimenteraren vill spåra nervceller över dessa längre filer, se till att fokalplanet inte ändras och att förberedelsen inte rör sig. Slutligen är ett ytterligare sätt att dirigera tillräckligt med ljus till handdatorn att använda yngre djur, som har tunnare och därmed mindre ogenomskinliga ganglier.
Från tid till annan finner vi att signal-till-brusförhållandet för de optiska signalerna försämras och/ eller motorprogramrytmen är suboptimala (t.ex. långsamma eller onormala). När detta börjar ske konsekvent blandar vi nya lösningar av VSD. Alikvoter av VSD förblir vanligtvis livskraftiga i ca 6 månader i en -20 °C frys. Relaterat är det värt att notera att för Berghiahar de bästa resultaten hittills erhållits med absorbansen VSD RH482. Eftersom RH482 är mer lipofila än RH155, kan det bättre fläcka Berghiasjämförelsevis mindre nervceller eller förbli i neuronala membran mer effektivt vid den högre inspelnings saltlösningstemperaturen som används för denna tropiska art.
En begränsning av PDA-baserad avbildning av neural aktivitet avser AC-kopplingen av spänningssignalerna i hårdvara före 100x preamplification-steget: även om detta representerar en nödvändig funktion för att ta bort den stora DC-offset som produceras av den höga viloljusnivån som krävs enligt denna teknik, utesluter AC-kopplingen inneboende i handdatorn mätningen av långsamma förändringar i membranpotentialen, till exempel de som är associerade med synaptiska indata. Om du vill registrera potentiella förändringar i långsamt eller stabilt tillstånd kan ett DC-kopplade CMOS-kameraavbildningssystem användas för att fånga subthreshold-aktivitet. Byrne och kollegor använde nyligen en sådan inställning med RH155 för att avbilda neurons aktivitet i den buccal ganglion av Aplysia17,18. Vi har använt båda systemen och funnit att CMOS-kameran, på grund av dess mycket högre densitet av detektorer (128 x 128), genererar 50x större datafiler för samma bildtid7. Handdatorns mindre filer underlättar snabbare bearbetning och analys. Detta möjliggör också utökade inspelningar med en enda studie (figur 4) och studier av lärande, där data från flera försök sammanfogas till en stor fil före spiksortering, vilket gör det möjligt att spåra nätverksorganisation när lärandet utvecklas19.
I andra kamerabaserade undersökningar har fluorescerande VSDs använts av Kristan och kollegor för att undersöka nätverksfunktionen i leechens segmentella ganglier. I en inflytelserik studie ledde detta till identifiering av en neuron som är involverad i djurets beslut att simma eller krypa20. I en annan studie undersökte Kristan et al. i vilken utsträckning leechs simning och krypande beteenden drivs av multifunktionella kontra dedikerade kretsar21. Mer nyligen använde Wagenaar och kollegor ett tvåsidigt mikroskop för spänningsavbildning som gör det möjligt för dem att spela in från nästan alla nervceller i en leech segmental ganglion22. Till skillnad från många kamerabaserade bildframställningsmetoder är en fördel med vår PDA-baserade bildmetod snabb och opartisk spiksortering av ICA, en form av blind källseparation som inte innebär några beslut om neuronala gränser för resultatbehandling.
När det gäller valet av VSDs är en fördel med absorbansfärgerna RH155 och RH482 den lilla till ingen fototoxicitet som är associerad med dem23,24, vilket möjliggör längre inspelningstider än vad som är typiskt för fluorescerande VSDs. Dessutom är de snabba absorbans VSD: er vi använder väl lämpade för att registrera de överspäckande somatiska åtgärdspotentialerna i snäckor, som vanligtvis är 80 mV i amplitud. Som visas i figur 3Gkan vår optiska metod registrera potentiella undershoots (ingen av våra inspelningar är spårgenomsnitt): Detta tyder på att de VSDs vi använder bör kunna urskilja åtgärdspotentialer i andra modellsystem som dämpas i viss utsträckning och därmed inte överskrider när de når soma. Ändå kanske vår optiska metod inte är idealisk för arter som är kända för att uppvisa mycket försvagade verkning potentialer när de registreras i soma.
Mycket aktuell forskning om neurala nätverk fokuseras på ett litet antal designer transgena arter. Neurovetenskap drar dock nytta av studien av en mängd olika fylogenetiskt distinkta arter. Att studera många olika arter ger insikter om hur kretsar utvecklas25,26, och belyser principer för nätverksfunktion som kan vara vanliga över phyla1,2,3,4,27. Vi har hittills tillämpat vår bildframställningsmetod på ett antal snäckor, inklusive Aplysia californica8,11,12,13,14,28, Tritonia diomedea8,9,11,14,19,28, Tritonia festiva28, Pleurobranchaea californica (opublicerade data) och nu senast Berghia stephanieae (Figur 5). En vädjan till detta tillvägagångssätt är att det lätt kan tillämpas på många arter, utan behov av transgena djur. Vi vill erkänna att vår användning av VSD-avbildning med snabba absorbansfärger och en handdator följer i fotspåren av banbrytande arbete som uppnådde detta i halv intakta, beter sig Navanax29 och Aplysia30 förberedelser. Vår betoning på snabbheten i vårt tillvägagångssätt är delvis ett svar på oro för att många utredare kan vara alltmer ovilliga att initiera nätverksstudier på nya arter på grund av rädsla för att år av studier kommer att vara nödvändiga för att karakterisera grundläggande nätverksorganisation innan de kan utforska vetenskapliga frågor av brett intresse för neurovetenskap31. Vårt mål här är därför att demonstrera en teknik som i hög grad påskyndar processen – till den grad att betydande insikter samma dag om nätverksorganisation kan erhållas från enstaka förberedelser.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NSF 1257923 och NIH 1U01NS10837. Författarna vill erkänna Jean Wangs hjälp i laboratoriet.
Achromat 0.9 NA swing condenser | Nikon | N/A | |
Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 with SC-20 | Controls perfusion saline temperature |
Chamber thermometer | Physitemp | BAT-12 with IT-18 microprobe | |
Digital camera | Optronics | S97808 | |
Dissecting forceps | Dumont | #5 | |
Dissecting scissors | American Diagnostic Corp. | ADC-3410Q | |
Imaging microscope | Olympus | BX51WIF | |
Imaging perfusion chamber | Siskiyou | PC-H | |
Instant Ocean | Instant Ocean | SS6-25 | Makes 25 gallons at a time |
Master-8 pulse stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
Microdispenser | Drummond Scientific | 3-000-752 | Dye applicator for pressure staining |
Microdissection scissors | Moria | 15371-92 | |
Minutien pins (0.1 mm) | Fine Science Tools | NC9677548 | For positioning and stabilizing CNS |
Motorized microscope platform | Thorlabs | GHB-BX | Gibraltar platform |
NeuroPlex imaging software | RedShirtImaging | NeuroPlex | Compatible with the WuTech photodiode array |
Objective lenses | Olympus | XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340 | |
PE-100 polyethylene tubing | VWR | 63018-726 | Tubing to make suction electrodes |
Perfusion pump | Instech | P720 with DBS062SDBSU tube set | |
Petroleum jelly | Equate | NDC 49035-038-54 | |
Photodiode array with control panel | WuTech Instruments | 469-IV photodiode array | Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information |
RH155 | Santa Cruz Biotechnology | sc-499432 | Voltage-sensitive dye |
RH482 | Univ of Conn. Health Center | JPW-1132 | Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow |
Silicone earplugs | Mack's | Model 7 | To be use for preparation compression |
Staining PE tubing | VWR | 63018-xxx | Different sizes depending on fit |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
Thorlabs LED and driver | Thorlabs | M735L2-C1, DC2100 | LED lamp and driver |
Tygon tubing | Fisher Scientific | 14-171-xxx | |
Vibration isolation table | Kinetic Systems | MK26 | Spring-based |