Здесь сообщается о системе визуализации кальция у свободно ведущих себя Caenorhabditis elegans с хорошо контролируемой, нелокализованной вибрацией. Эта система позволяет исследователям вызывать нелокализованные вибрации с хорошо контролируемыми свойствами при наномасштабном смещении и количественно оценивать токи кальция во время реакций C. elegans на колебания.
Нелокализованные механические силы, такие как вибрации и акустические волны, влияют на широкий спектр биологических процессов от развития до гомеостаза. Животные справляются с этими раздражителями, изменяя свое поведение. Понимание механизмов, лежащих в основе такой поведенческой модификации, требует количественной оценки нейронной активности во время интересующего поведения. Здесь мы сообщаем о методе визуализации кальция при свободном поведении Caenorhabditis elegans с нелокализованной вибрацией определенной частоты, смещения и продолжительности. Этот метод позволяет производить хорошо контролируемую, нелокализованную вибрацию с использованием акустического преобразователя и количественно определять вызванные реакции кальция при одноэлементном разрешении. В качестве доказательства принципа показан кальциевая реакция одного интернейрона, AVA, во время реакции выхода C. elegans на вибрацию. Эта система облегчит понимание нейронных механизмов, лежащих в основе поведенческих реакций на механические раздражители.
Животные часто подвергаются воздействию нелокализованных механических раздражителей, таких как вибрации или акустические волны 1,2. Поскольку эти стимулы влияют на гомеостаз, развитие и размножение, животные должны изменить свое поведение, чтобы справиться с ними 3,4,5. Однако нейронные цепи и механизмы, лежащие в основе такой поведенческой модификации, плохо изучены.
Механосенсорное поведение у нематоды, Caenorhabditis elegans, представляет собой простую поведенческую парадигму, в которой черви обычно изменяют поведение от движения вперед к обратной реакции побега, когда они сталкиваются с нелокализованной вибрацией6. Нейронная цепь, лежащая в основе этого поведения, состоит в основном из пяти сенсорных нейронов, четырех пар интернейронов и нескольких типов двигательных нейронов 7,8. Кроме того, черви привыкают к таким механическим раздражителям после интервальной тренировки, включающей повторную стимуляцию 9,10,11. Таким образом, эта простая поведенческая реакция представляет собой идеальную систему для исследования нейронных механизмов, лежащих в основе как нелокализованного вибрационного поведения, так и памяти. Проиллюстрирован протокол визуализации кальция у свободно ведущих себя червей под воздействием нелокализованных колебаний. По сравнению с ранее сообщенными системами, эта система проста тем, что не требует дополнительной камеры для слежения; однако это позволяет нам изменять частоту, смещение и продолжительность нелокализованной вибрации. Поскольку активация интернейронов AVA индуцирует обратную реакцию побега, черви, совместно экспрессирующие GCaMP, индикатор кальция, и TagRFP, нечувствительный к кальцию флуоресцентный белок, под контролем AVA-специфического промотора были использованы в качестве примера (см. Таблицу материалов для деталей). Протокол демонстрирует активацию нейронов AVA, когда червь переключается с движения вперед на движение назад. Этот протокол облегчает понимание механизма нейронной цепи, лежащего в основе механосенсорного поведения.
Как правило, количественная оценка нейронной активности требует введения зонда и / или ограничений на движение тела животного. Однако для исследований механосенсорного поведения инвазивное введение зонда и сами ограничения представляют собой механические раздражители. C. elegans пр…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis за предоставление штаммов, используемых в этом исследовании. Эта публикация была поддержана JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), по инновационным направлениям проекта «Наука о мягких роботах» (Грант No. JP18H05474), PRIME от Японского агентства медицинских исследований и разработок (номер гранта 19gm6110022h001) и фонда Shimadzu.
Data anaylsis software | |||
DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
Escherichia coli and C. elegans strains | |||
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
Laser Doppler vibrometer | |||
Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
Mouse macro system | |||
Assay.txt | Autore | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
Nematode growth media plate | |||
Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
Nonlocalized vibration device | |||
Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
Noninvasive calcium imaging | |||
2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
Microscope | Olympus | MVX10 | |
sCMOS camera | Andor | Zyla | |
x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
Plasmid | |||
pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
Tracking software | |||
homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |