रक्त-व्युत्पन्न न्यूरोनल कोशिकाओं की जीएम-मुक्त पीढ़ी
Summary
हम एक आनुवंशिक रूप से संशोधित मुक्त (जीएम मुक्त) विधि प्रस्तुत करने के लिए एक न्यूरोनल फेनोटाइप के साथ कोशिकाओं को पुनः प्रोग्रामेड परिधीय रक्त कोशिकाओं से प्राप्त करने के लिए । उपन्यास मानव जीपीआई से जुड़े प्रोटीन से जुड़े एक सिग्नलिंग मार्ग की सक्रियता मानव pluripotent स्टेम सेल प्राप्त करने के लिए एक कुशल जीएम मुक्त विधि से पता चलता है ।
Abstract
कई मानव तंत्रिका संबंधी विकार मस्तिष्क में न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं के पतन के कारण होते हैं। औषधीय और अन्य चिकित्सीय रणनीतियों में सीमाओं के कारण, वर्तमान में घायल या रोगग्रस्त मस्तिष्क के लिए कोई इलाज उपलब्ध नहीं है। सेल रिप्लेसमेंट न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों के लिए एक आशाजनक चिकित्सीय रणनीति के रूप में दिखाई देता है। इस दिन के लिए, तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) सफलतापूर्वक भ्रूण ऊतकों, मानव भ्रूण कोशिकाओं (ES) या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) से उत्पन्न किया गया है । उपन्यास मानव जीपीआई से जुड़े ग्लाइकोप्रोटीन की सक्रियता द्वारा डिफेक्शन की एक प्रक्रिया शुरू की गई थी, जिससे प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का उत्पादन होता है। ये रक्त-व्युत्पन्न pluripotent स्टेम सेल (बीडी-पीएससी) ब्राइटफील्ड और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाए गए तंत्रिका फेनोटाइप के साथ कोशिकाओं में विट्रो में अंतर करते हैं। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से इन कोशिकाओं का अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण उनकी आदिम संरचना के साथ-साथ न्यूरोनल जैसी आकृति विज्ञान और उपकोशिक विशेषताओं की पुष्टि करता है।
Introduction
बुनियादी और पूर्व नैदानिक स्टेम सेल अनुसंधान विधियों का विकास न्यूरोलॉजिकल रोगों के लिए स्टेम सेल आधारित उपचारों के नैदानिक आवेदन को प्रोत्साहित करता है। इस तरह की संभावित चिकित्सा गंभीर रूप से मानव तंत्रिका कोशिकाओं के उत्पादन के लिए विधि पर निर्भर करती है जिससे कार्यात्मक वसूली होती है1.
तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) वयस्क न्यूरोजेनेसिस नामक प्रक्रिया में जीवन भर नए न्यूरॉन्स में आत्म-नवीनीकरण और अंतर करते हैं। केवल बहुत प्रतिबंधित मस्तिष्क क्षेत्रों में वयस्कता में नवजात न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए सक्षम एनएससी बंदरगाह। इस तरह के एनएससी परिपक्व न्यूरॉन्स को जन्म दे सकते हैं, जो सीखने और स्मृति में शामिल हैं, इस प्रकार खोए हुए या क्षतिग्रस्त न्यूरॉन्स की जगह लेते हैं। दुर्भाग्य से, ये एनएससी प्रतिबंधित मात्रा में मौजूद हैं और किशोर विकास2के दौरान यह सीमित न्यूरोजेनेसिस तेजी से घटता है। इसलिए, तंत्रिका कोशिकाओं के अन्य स्रोतों पर सेल थेरेपी उद्देश्य में विचार किया जाना चाहिए।
डिजेनेरेटिव न्यूरोलॉजिकल बीमारियों को मानक औषधीय दृष्टिकोणों का उपयोग करके इलाज करना मुश्किल है। कई इम्मीडिकेबल न्यूरोलॉजिकल विकारों को गले लगाने के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियां रोगग्रस्त और घायल ऊतकों के सेल प्रतिस्थापन उपचारों पर आधारित हैं। एनएससी प्रत्यारोपण क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की जगह ले सकता है और लाभकारी प्रभाव प्रदान कर सकता है । तंत्रिका कोशिका प्रतिस्थापन के लिए अन्य स्रोतों में मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाएं (ईएससी) शामिल हैं, जो स्तनधारी ब्लास्टोसिस्ट3के भीतरी सेल द्रव्यमान के साथ-साथ आईपीएससी4से प्राप्त होती हैं, जिनके पास ईएसएसी जैसी व्यापक आत्म-नवीकरण क्षमता होती है और विभिन्न सेल वंशों में अंतर करने में सक्षम होते हैं। एनएससी को मानव फाइब्रोब्लास्ट से सीधे रीप्रोग्रामिंग द्वारा भी उत्पन्न किया जा सकता है, जो pluripotent राज्य5से बचते हैं ।
सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी अभी भी एक चुनौतीपूर्ण मुद्दा है। हालांकि ईएससी, भ्रूण, या आईपीएस कई असाध्य तंत्रिका संबंधी रोगों के इलाज के लिए न्यूरोनल कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक स्रोत हो सकता है, क्षतिग्रस्त ऊतकों के ऑटोलॉगस वयस्क एससी सेल प्रतिस्थापन एक बेहतर विकल्प है जो प्रतिरक्षा, नैतिक और सुरक्षा चिंताओं को दरकिनार करता है।
PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN के फॉस्फोरिलेशन के माध्यम से एंटीबॉडी-क्रॉसलिंकिंग द्वारा मानव जीपीआई से जुड़े प्रोटीन की सक्रियता रक्त जनक कोशिकाओं और रक्त व्युत्पन्न pluripotent स्टेम सेल (बीडी-PSCs)6की पीढ़ी के एक अलग शुरू करती है । ये कोशिकाएं ब्राइटफील्ड, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) विश्लेषण के माध्यम से पुष्टि के रूप में न्यूरोनल कोशिकाओं की ओर विट्रो में अंतर करती हैं।
इस काम में हम बीडी-पीएससी की जीएम-मुक्त पीढ़ी और न्यूरोनल फेनोटाइप के साथ कोशिकाओं में उनके सफल पुनर्भेदन का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस कार्य में वर्णित मानव कोशिकाओं को पुन: प्रोग्राम करने की गैर-जीएम विधि जीपीआई से जुड़ी मानव झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन के पीछे सिग्नलिंग (एस) मशीनरी के नाभिक सक्रियण के लिए झिल्ली पर आधारित है जो अपवर्त?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डॉ रेनर कुसुम की स्मृति को समर्पित।
लेखक विशेष रूप से जोस मैनुअल गार्सिया-वर्डुगो और विसेंट हेरांज-पेरेज के लिए आभारी हैं, जो तुलनात्मक न्यूरोबायोलॉजी की प्रयोगशाला में ईएम प्रयोगों और विश्लेषण, कैवनेल्स इंस्टीट्यूट ऑफ बायोडायलॉजी एंड इवोल्यूशनरी बायोलॉजी, वेलेंसिया विश्वविद्यालय, CIBERNED, वालेंसिया, स्पेन, जो उत्कृष्टता अनुसंधान समूहों PROMETEO/2019/075 के लिए Prometeo अनुदान से अनुसंधान वित्तपोषण द्वारा समर्थित था । इस काम के बाकी एसीए सेल बायोटेक GmbH हीडलबर्ग, जर्मनी द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
Riferimenti
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