Generazione priva di OGM di cellule neuronali derivate dal sangue

Summary

Presentiamo un metodo privo di OGM per ottenere cellule con un fenotipo neuronale da cellule del sangue periferiche riprogrammate. L'attivazione di un percorso di segnalazione collegato a nuove proteine umane legate alla GPI rivela un metodo efficiente privo di OGM per ottenere cellule staminali pluripotenti umane.

Abstract

Molti disturbi neurologici umani sono causati dalla degenerazione di neuroni e cellule gliali nel cervello. A causa delle limitazioni nelle strategie farmacologiche e in altre strategie terapeutiche, attualmente non è disponibile alcuna cura per il cervello ferito o mato. La sostituzione cellulare appare come una promettente strategia terapeutica per le condizioni neurodegenerative. Ad oggi, le cellule staminali neurali (NSC) sono state generate con successo da tessuti fetali, cellule embrionali umane (ES) o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Un processo di dedifferenziazione è stato avviato dall'attivazione della nuova glicoproteina umana legata alla GPI, che porta alla generazione di cellule staminali pluripotenti. Queste cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSC) si differenziano in vitro in cellule con un fenotipo neurale come dimostrato dalla microscopia a campo luminoso e immunofluorescenza. L'analisi ultrastrutturale di queste cellule mediante microscopia elettronica conferma la loro struttura primitiva, nonché la morfologia neuronale e le caratteristiche subcellulari.

Introduction

Lo sviluppo di metodi di ricerca sulle cellule staminali di base e preclinali incoraggia l'applicazione clinica di terapie a base di cellule staminali per le malattie neurologiche. Tale potenziale terapia dipende in modo critico dal metodo per la generazione di cellule neurali umane che porta al recupero funzionale¹.

Le cellule staminali neurali (NSC) si rinnovano e si differenziano in nuovi neuroni per tutta la vita in un processo chiamato neurogenesi adulta. Solo aree cerebrali molto ristrette ospitano NSC competenti a generare neuroni appena nati in età adulta. Tali NSC possono dare origine a neuroni maturi, che s....

Protocol

Le approvazioni etico sono state ottenute durante l'esecuzione degli esperimenti.

1. Isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMNC)

1. Garantire che tutti i donatori hanno firmato il consenso informato prima del ritiro del sangue nel rispetto delle linee guida istituzionali.
2. Prendi 30 mL di sangue da donatori sani da personale medico addestrato secondo il protocollo standard.
3. Isolare i PBMIC in base ai supporti gradienti di densità. Utilizzare 10 mL di mezzi con 25 mL di sangue 1:1 diluito con tampone di fosfato salina (PBS) e centrifuga a 300 x g per 30 min.
4. Isolare l....

Results

I risultati forniscono la prova che questo nuovo metodo privo di OGM è in grado di ripristinare le cellule progenitrici del sangue al loro stato più primitivo senza agire direttamente sul genoma umano.

Abbiamo precedentemente dimostrato che il crosslinking di anticorpi specifici della proteina legata alla GPI inizia tramite PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation di geni altamente conservati rilevanti per lo sviluppo come WNT, NOTCH e C-Kit, avviando così un processo di dedifferentiazion.......

Discussion

Il metodo non GM di riprogrammazione delle cellule umane descritto in questo lavoro si basa sull'attivazione da membrana a nucleo di macchinari di segnalazione dietro la glicoproteina a membrana umana legata alla GPI che avvia il processo di dedifferentiazione che porta alla generazione ex vivo e all'espansione di PSC autorenonti ottenuti da sangue periferico umano non manipolato. Queste cellule, se coltivate in mezzi appropriati, sono in grado di ri-differenziarsi in cellule appartenenti a diversi strati

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Frazione di albumina V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 coniugato	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestina Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
Kit per la vitalità cellulare AO/PI	Biozym	872045	Biozym fuori produzione. Il prodotto realizzato da Logos Biosystems.
Acido ascorbico 2-fosfato sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Senza siero 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Soluzione di base FGF	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	Terreni di gradiente
di densità BSA Frac V 7,5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	microsfere magnetiche di dimensioni nanometriche
Vetrini per conteggio cellulare Luna	Biozym	872010	Biozym fuori produzione. Il prodotto realizzato da Logos Biosystems.
Vetrini per camera Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	resina epossidica
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Fuori produzione. Disponibile sotto: TMS-013-B
GDNF umano ricombinante	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutammina
Grado di glutaraldeide	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Eparina sodica cellula	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
BDNF umano	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Citrato di piombo	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Contatore di cellule automatizzato	Biozym	872040	Biozym fuori produzione. Il prodotto realizzato da Logos Biosystems.
Tampone MACS	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsä ulen	Miltenyi	130-042-201
Fotocamera digitale Morada	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 pozzetti	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplemento 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranile acetato C	EMS	22400