Vi tilbyr en protokoll for å generere en farmakologisk DYT / PARK-ATP1A3 dystoni mus modell via implantasjon av kanyler i basale ganglier og lillehjernen koblet til osmotiske pumper. Vi beskriver induksjonen av dystonilignende bevegelser ved bruk av en motorutfordring og karakterisering av fenotypen via atferdspoengsystemer.
Genmodifiserte musemodeller står overfor begrensninger, spesielt når man studerer bevegelsesforstyrrelser, hvor de fleste tilgjengelige transgene gnagermodeller ikke presenterer en motorfenotype som ligner de kliniske aspektene ved den menneskelige sykdommen. Farmakologiske musemodeller gir mulighet for en mer direkte studie av pathomechanisms og deres effekt på atferdsfenotypen. Osmotiske pumper koblet til hjernekanyler åpner muligheten for å lage farmakologiske musemodeller via lokal og kronisk legemiddellevering. For den arvelige bevegelsesforstyrrelsen av rask dystoni-parkinsonisme kan tap av funksjonsmutasjon i α3-underenheten av Na+/ K+-ATPase simuleres av en svært spesifikk blokade via glykosidabain. For å lokalt blokkere α3-underenheten i basalgangliene og lillehjernen, som er de to hjernestrukturene som antas å være tungt involvert i patogenesen av rask dystoni-parkinsonisme, blir en bilateral kanyle stereotaxisk implantert inn i striatum og en ekstra enkelt kanyle blir introdusert i lillehjernen. Kanylene er koblet via vinylrør til to osmotiske pumper, som er subkutant implantert på baksiden av dyrene og tillater kronisk og presis levering av ouabain. Den farmakologiske musemodellen for rask dystoni-parkinsonisme bærer den ekstra fordelen av å rekatolere de kliniske og patologiske egenskapene til asymptomatiske og symptomatiske mutasjonsbærere. Akkurat som mutasjonsbærere av rask dystoni parkinsonisme utvikler ouabain-perfused musene dystonilignende bevegelser først etter ytterligere eksponering for stress. Vi viser et mildt stressparadigme og introduserer to modifiserte poengsystemer for vurdering av en motorfenotype.
Fordelene med en kontinuerlig legemiddellevering direkte inn i hjernen er mange. Repeterende og hyppige injeksjoner, som representerer en unødvendig stressfaktor for dyr, kan unngås og en mer konstant intracerebral konsentrasjon av stoffet kan oppnås. Dette er spesielt gyldig når systemisk administrerte legemidler ikke lett trenger inn i blodhjernsbarrieren. Videre, kronisk narkotika levering via osmotiske pumper gjør det mulig for lokalisert levering av substrater som ellers ville ha systemomfattende bivirkninger. Legemidlene kan leveres på en målrettet måte til de ønskede hjernestrukturene, den resulterende effekten kan dermed spores direkte. Dette kan benyttes for en rekke applikasjoner, for eksempel studiet av terapeutiske effekter samt studiet av pathomechanisms. Denne siste applikasjonen ble brukt i prosjektet heri for å lage en farmakologisk musemodell for dystoni.
Analysen og forståelsen av dystoniske syndromer, som representerer den tredje vanligste bevegelsesforstyrrelsen, har vært sterkt begrenset av det faktum at genetiske dyremodeller i stor grad ikke klarer å reprodusere sykdommen fenotype som finnes i syke mennesker, så vel som patofysiologien. Dette problemet er ikke begrenset til dystoniske syndromer, men faktisk gjelder mange transgene gnagermodeller innen bevegelsesforstyrrelser1,2. Årsaken til mangelen på fenotype i transgene gnagermodeller kan være basert på svært effektive kompenserende mekanismer3. I tilfelle av dystoni er sykdommen preget av ufrivillige muskelsammentrekninger som forårsaker vridning bevegelser og unormale stillinger4. Studien av sekundære årsaker (f.eks. hjerneskade) av dystoniske symptomer, har bidratt til å identifisere strukturene som er involvert i manifestasjonen av disse motoriske abnormitetene, for eksempel basal ganglia5. Hjerneavbildningsstudier av arvelige former for dystoni har vist funksjonelle abnormiteter i nesten alle hjerneregioner som er ansvarlige for motorkontroll og sensoriskintegrasjon 6,,7. Imidlertid er gnagermodeller fortsatt nødvendig for å utdype forståelsen av nevrale dysfunksjoner på molekylært og stort nettverksnivå, samt for utvikling av terapeutiske alternativer. Det er her farmakologiske musemodeller gir mulighet til å gjenskape de kliniske og patologiske egenskapene til en sykdom på en mer presis måte.
Rask dystoni-parkinsonisme (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) er en av de arvelige former for dystoni. Det er forårsaket av tap av funksjonsmutasjoner i ATP1α3-genet, som koder for α3-underenheten til Na+/K+-ATPase8. Videre er det anerkjent at genmutasjonsbærere kan være fri for symptomer i mange år før de akutt utvikler vedvarende generalisert dystoni og parkinsonisme etter eksponering for en stressende hendelse. Faktisk er penetrance av DYT / PARK-ATP1A3 ufullstendige og stressende hendelser som fungerer som en utløser varierer fra fysisk overexertion og ekstreme temperaturer til overforbruk av alkohol og infeksjoner9,10. For å studere DYT / PARK-ATP1A3 og for å finne potensielle terapeutiske inngrep, har det blitt prøvd mange ganger for å etterligne stressavhengig sykdomsutvikling i gnagermodeller. Men bortsett fra den eksisterende genetiske DYT / PARK-ATP1A3 musemodellen, hvor forbigående unormale og krampelignende bevegelser ble indusert av hypotermi, har alle publiserte genetiske musemodeller for DYT / PARK-ATP1A3 ikke klart å produsere dystoniske symptomer1,11,12. Calderon et al. har tidligere vist at blokkering av α3-underenheten bilateralt i basalgangliaene og lillehjernen via hjerteglykosid ouabain hos villtypemus resulterer i mild gangforstyrrelse13. Den ekstra eksponeringen for elektriske fotstøt i et varmt miljø førte til en dystonisk og bradykinetisk fenotype, og viste dermed at kronisk og målrettet perfusjon av ouabain etterfulgt av stress imiterer DYT / PARK-ATP1A3 fenotype.
Men å utsette dyr for elektriske fotstøt i et varmt miljø på 38-40 ° C over en to timers periode induserer smerte og angst hos dyr, noe som representerer forvirrende faktorer, spesielt for vurdering av endringer i katekolaminsystemet knyttet til utvikling av dystoni. Dermed beskriver vi her en annen type stressparadigme med høy translasjonell verdi, som relaterer seg tilbake til det faktum at mild til moderat trening har blitt beskrevet som utløsere hos DYT / PARK-ATP1A3 pasienter9. Videre er repeterende trening en velkjent utløser for fokal dystoni14. Mus ble gjentatte ganger utsatt for utfordrende motoriske oppgaver bestående av tre nedstammer av en trestang (“pole test”) og tre løp på et Rotarod-apparat (“Rotarod ytelsestest”). Plasseringen av dyr på toppen av en 50 cm trestang ble brukt til å tvinge dyrene til å stige ned, Rotarod-apparatet ble ansatt for å utsette mus for tvungen aktivitet ved å plassere dem på en roterende stang.
Karakteriseringen av motorfenotypen til en musemodell for dystoni er spesielt utfordrende på grunn av mangel på forhåndsdefinerte tester og score. Imidlertid har en variant av en motorisk funksjonshemmingsvurdering gjentatte ganger blitt brukt i løpet av de siste årene for å evaluere alvorlighetsgraden og fordelingen av dystonilignende bevegelser hos gnagere13,,15,,16. Vi presenterer her en modifisert versjon av dystonivurderingsskalaen, som viste seg å være effektiv i evalueringen av dystonilignende fenotype dyr når det observeres over en tidsperiode på fire minutter. Som en annen metode for å vurdere dystonilignende bevegelser, presenterer vi et nyutviklet poengsystem for vurdering av unormale bevegelser under en halefjæringstest. Det gjør det mulig å vurdering av hyppigheten og varigheten av dystonilignende bevegelser og stillinger av de fremre lemmer, bakben samt trunk.
Denne DYT/PARK-ATP1A3 farmakologiske musemodellen muliggjør detaljert analyse av intracerebrale strukturelle og nevrokjemiske endringer indusert utelukkende ved hemming av natriumkaliumionpumpen i basalgangene og lillehjernen, samt endringer knyttet til stresseksponering. Ved mus kan maksimalt to osmotiske pumper implanteres subkutant. Vi presenterer her en metode som beskriver kronisk legemiddellevering til flere hjernestrukturer ved å implementere en dobbel kanyle koblet til en bifurcation adapter i tillegg til en enkelt kanyle. Denne metodikken kan brukes til ethvert program som krever at flere hjernestrukturer skal perfunderes samtidig og kronisk.
Vi presenterer en musemodell av en sjelden bevegelsesforstyrrelse, hvor pasienter utvikler permanente symptomer etter eksponering for stress. Denne antatte gen-miljømessige interaksjonen er fortsatt ikke godt forstått, men kan representere en av de viktigste pathomechanisms i DYT / PARK-ATP1A3 utvikling. Ulike metoder for å utsette mus for stress har blitt publisert tidligere og inkluderer elektriske fotstøt, begrensning, kaldt eller varmt miljø og eksponering for ulikelukt 11,,12,,13. I et forsøk på å utsette mus for en mild stressfaktor med translasjonell verdi, beskriver vi her den repeterende subjektive subjektive subjektive subjektive aktiviteten av mus for utfordrende motoriske oppgaver. For polet test, ouabain-perfused dyr avslørt ufrivillig hyperextension av fremre lemmer og hindlimbs. Disse bevegelsene var svært lik dystonilignende bevegelser observert under 4-min videoopptak av dyrene, samt halefjæringstesten. Anvendelsen av mildt stress i form av utfordrende motoriske oppgaver kan være nyttig i andre musemodeller som viser motoriske symptomer eller nevrodegenerasjon, hvor gen-miljømessige interaksjoner påvirker graden av sykdomsprogresjon.
Det er en generell mangel på forhåndsdefinerte atferdsoppgaver samt vurderingsskalaer for å klassifisere unormale bevegelser og stillinger hos mus. De fleste tilgjengelige motoroppgaver avslører uspesifikke abnormiteter, for eksempel hindlimb-låsing, som er et velkjent fenomen i mange musemodeller av bevegelsesforstyrrelser med nevrodegenerasjon18,,19. For riktig karakterisering av fenotype er det imidlertid nødvendig å analysere om musemodellen rekasitulerer de viktigste egenskapene til sykdommen. Her presenterer vi den modifiserte versjonen av en dystoni rating skala som brukes tidligere for vurdering av motorisk funksjonshemming i dystoni musemodeller15,16. Vi utviklet i tillegg et observatørbasert poengsystem for halefjæringstesten, som ble etablert på samme måte som de kliniske vurderingsskalaene til menneskelig dystoni. Begge vurderingsskalaene viser en signifikant høyere score hos ouabain-perfused, stressede mus sammenlignet med ouabain-perfused, ikke-stresset dyr samt kjøretøy-perfused dyr. Ulempene ved ethvert observatørbasert poengsystem er nødvendig opplæring av ratere for å sikre konsekvent scoring og for å redusere observatørvariabilitet, samt faren for en mulig skjevhet av rateren hvis ikke helt blindet for gruppen analysert. Observatørbaserte poengsystemer presenterer imidlertid fortsatt en lett tilgjengelig metode for å karakterisere en fenotype og kan tilpasses musemodellen analysert, som gjort i det nåværende prosjektet for vurdering av dystonilignende bevegelser. For å sikre konsekvent scoring blant ulike ratere, bør opplæringsvideoer gjøres tilgjengelig. For å redusere potensielle skjevheter anbefales det at forskjellige ratere scorer de samme videoklippene, og at de enkelte poengsummene er gjennomsnittlig. Begge scoringssystemene nevnt i dette arbeidet registrerer tilstedeværelsen av dystonilignende bevegelser hos dyr. Vurderingsskalaene kan tilpasses i henhold til de spesifikke kravene i et prosjekt, som gjort tidligere av Ip et al., hvor utelukkende baklimbs ble scoret for dystoni-lignende bevegelser i en musemodell for dystoni 1 (DYT-TOR1A)20. Vurderingsskalaene kan suppleres med andre tidligere publiserte poengsystemer, og vurderer for eksempel graden av bradykinesi hos gnagere som gjort med bevegelseshemmingsscoren av Calderon et al.13.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Det føderale departementet for utdanning og forskning (BMBF DysTract til C.W.I.) og av Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) ved Universitetet i Würzburg (Z2-CSP3 til L.R.). Forfatterne takker Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger og Heike Menzel og for deres tekniske assistanse samt Helga Brünner for dyrepleien.
0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
Bulldog Clamps | Agntho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
Cannula and Minipump Holder | Stoelting | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting | 56109M | |
Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
Octenisept | Schülke | 118211 | |
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
Rectal Thermal Probe | Stoelting | 50304 | |
Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting | 53800M | |
RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
screw driver set | Agntho's | 30090-6 | |
Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
StereoDrive | Neurostar | software | |
Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
Stereotaxic robot | Neurostar | ||
suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |