Vi tillhandahåller ett protokoll för att generera en farmakologisk DYT/PARK-ATP1A3 dystoni mus modell via implantation av kanylerna i basala ganglierna och lillhjärnan ansluten till osmotiska pumpar. Vi beskriver induktion av dystoni-liknande rörelser via tillämpning av en motor utmaning och karakterisering av fenotyp via beteendemässiga poängsystem.
Genetiskt modifierade musmodeller möter begränsningar, särskilt när man studerar rörelsestörningar, där de flesta av de tillgängliga transgena gnagarmodellerna inte presenterar en motorisk fenotyp som liknar de kliniska aspekterna av den mänskliga sjukdomen. Farmakologiska musmodeller möjliggör en mer direkt studie av pathomechanisms och deras effekt på beteendemässiga fenotyp. Osmotiska pumpar som är anslutna till hjärnkanyler öppnar möjligheten att skapa farmakologiska musmodeller via lokal och kronisk läkemedelsleverans. För den ärftliga förflyttningsstörningen av snabb-debuten dystoni-parkinsonism, kan förlust-of-function mutationen i α3-subenhet av Na+/ K+-ATPase simuleras genom en mycket specifik blockad via glykosiden ouabain. För att lokalt blockera α3-subenhet i basala ganglierna och lillhjärnan, som är de två hjärnan strukturer tros vara starkt involverade i patogenesen vid snabb-debuten dystoni-parkinsonism, är en bilateral kanyl stereotaxically implanteras i striatum och en ytterligare enda kanyl införs i lillhjärnan. Kanylerna är anslutna via vinylslangar till två osmotiska pumpar, som subkutant implanteras på djurens baksida och möjliggör kronisk och exakt leverans av ouabain. Den farmakologiska mus modell för snabb-instövning dystoni-parkinsonism bär den ytterligare fördelen av recapitulating de kliniska och patologiska funktionerna i asymtomatiska och symptomatiskt mutation bärare. Precis som mutation bärare av snabb debut dystoni parkinsonism, ouabain-perfused möss utveckla dystoni-liknande rörelser först efter ytterligare exponering för stress. Vi visar en mild stress paradigm och införa två modifierade poängsystem för bedömning av en motor fenotyp.
Fördelarna med en kontinuerlig läkemedelsleverans direkt in i hjärnan är många. Repetitiva och frekventa injektioner, som utgör en onödig stressfaktor för djur, kan undvikas och en mer konstant intrakraniell koncentration av läkemedlet kan uppnås. Detta är särskilt giltigt när systemiskt administrerade läkemedel misslyckas med att lätt tränga igenom blod-hjärnbarriären. Dessutom, kronisk läkemedelsleverans via osmotiska pumpar möjliggör lokaliserad leverans av substrat som annars skulle ha systemomfattande biverkningar. Läkemedlen kan levereras på ett målinriktat sätt till de önskade hjärnstrukturerna, den resulterande effekten kan därmed direkt spåras. Detta kan utnyttjas för en rad applikationer, såsom studiet av terapeutiska effekter samt studiet av pathomechanisms. Denna sista ansökan användes i projektet häri för att skapa en farmakologisk musmodell för dystoni.
Analysen och förståelsen av dystonsyndrom, som representerar den tredje vanligaste rörelsestörningen, har varit starkt begränsad av det faktum att genetiska djurmodeller till stor del misslyckas med att reproducera sjukdomen fenotyp som finns i sjuka mänskliga samt patofysiologi. Denna fråga är inte begränsad till dystoniska syndrom, men i själva verket berör många transgena gnagare modeller inom området för rörelsestörningar1,2. Orsaken till avsaknaden av en fenotyp i modeller för transgena gnagare kan vara baserad på mycket effektiva kompensationsmekanismer3. När det gäller dystoni, sjukdomen kännetecknas av ofrivilliga muskelsammandragningar orsakar vrida rörelser och onormala ställningar4. Studien av sekundära orsaker (dvs, hjärnskada) av dystoniska symtom, har bidragit till att identifiera de strukturer som deltar i manifestationen av dessa motoriska avvikelser, såsom de basala ganglierna5. Hjärnavbildningsstudier av ärftliga former av dystoni har visat funktionella avvikelser i nästan alla hjärnregioner som ansvarar för motorisk kontroll och sensorimotorisk integration6,7. Emellertid, gnagare modeller behövs fortfarande för att fördjupa förståelsen av de neurala dysfunktioner på en molekylär och storskalig nätverksnivå samt för utveckling av terapeutiska alternativ. Det är där farmakologiska musmodeller erbjuder möjligheten att replikera de kliniska och patologiska egenskaperna hos en sjukdom på ett mer exakt sätt.
Snabb-debut dystoni-parkinsonism (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) är en av de ärftliga formerna av dystoni. Det orsakas av förlust-of-function mutationer i ATP1α3 genen, som kodar för α3-subenhet av Na+/ K+-ATPase8. Vidare är det erkänt att genmutation bärare kan vara fri från symptom i flera år innan akut utveckla långlivade generaliserade dystoni och Parkinsonism efter exponering för en stressande händelse. I själva verket är penemetris av DYT/PARK-ATP1A3 ofullständiga och stressande händelser som fungerar som en utlösare sträcker sig från fysisk överansträngning och extrema temperaturer till överkonsumtion av alkohol och infektioner9,10. För att studera DYT/PARK-ATP1A3 och för att hitta potentiella terapeutiska interventioner har man försökt många gånger att imitera den stressberoende sjukdomsutvecklingen hos gnagaremodeller. Men bortsett från den en befintliga genetiska DYT/PARK-ATP1A3 mus modell, där övergående onormala och konvulsion-liknande rörelser var framkallas av hypotermi, alla publicerade genetiska mus modeller för DYT/PARK-ATP1A3 har misslyckats med att producera dystoniska symtom1,11,12. Calderon et al. har tidigare visat att blockering av α3-subenheten bilateralt i basala ganglierna och lillhjärnan via hjärtglykosiden ouabain i vilda typ möss resulterar i mild gång störning13. Den ytterligare exponering för elektriska fot chocker i en varm miljö ledde till en dystonisk och bradykinetic fenotyp, vilket visar att kronisk och riktade perfusion av ouabain följt av stress framgångsrikt imiterar DYT/PARK-ATP1A3 fenotyp.
Att utsätta djur för elektriska fotchocker i en varm miljö på 38-40 °C under en tvåtimmarsperiod framkallar dock smärta och ångest hos djur, som representerar sammanbluffande faktorer, särskilt för bedömning av förändringar i katekolaminsystemet relaterat till utvecklingen av dystoni. Således beskriver vi häri en annan typ av stressparadigm med högt translationellt värde, som relaterar tillbaka till det faktum att mild till måttlig motion har beskrivits som utlösare i DYT/PARK-ATP1A3 patienter9. Dessutom är repetitiv motion en välkänd utlösande faktor för fokal dystoni14. Möss utsattes upprepade gånger för utmanande motoriska uppgifter bestående av tre nedstiger av en trästolpe (“stolpetest”) och tre körningar på en Rotarod-apparat (“Rotarod performance test”). Placeringen av djur på toppen av en 50 cm trästolpe användes för att tvinga djuren att stiga ner, rotarodapparaten var anställd för att utsätta möss för tvångsaktivitet genom att placera dem på en roterande stav.
Karakterisering av motor fenotyp av en mus modell för dystoni är särskilt utmanande på grund av bristen på fördefinierade tester och poäng. En variant av en bedömning av motorisk funktionsnedsättning har dock upprepade gånger använts under de senaste åren för att utvärdera svårighetsgraden och fördelningen av dystoniliknande rörelser hos gnagare13,15,16. Vi häri presentera en modifierad version av skalan dystonia betyg, som visat sig vara effektiva i utvärderingen av dystonia-liknande fenotyp av djur när observerats under en tidsperiod på fyra minuter. Som en andra metod för att bedöma dystonia-liknande rörelser, presenterar vi en nyligen utvecklat poängsystem för bedömning av onormala rörelser under en svans suspension test. Det möjliggör bedömning av frekvensen och varaktigheten av dystoni-liknande rörelser och ställningar av de främre extremiteterna, hindlimbs samt bålen.
Denna DYT/PARK-ATP1A3 farmakologiska mus modell möjliggör en detaljerad analys av intrakraniell strukturella och neurokemiska förändringar som framkallas enbart genom hämning av natrium-kaliumjon pumpen i basala ganglierna och lillhjärnan samt ändringar i samband med stress exponering. Vid möss kan högst två osmotiska pumpar subkutant implanteras. Vi häri presentera en metod som beskriver kronisk drug leverans till flera hjärnan strukturer genom att genomföra en dubbel kanyl ansluten till en bifurcation adapter förutom en enda kanyl. Denna metodik kan användas för alla program som kräver flera hjärnstrukturer att perfused samtidigt och kroniskt.
Vi presenterar en mus modell av en sällsynt rörlighet störning, där patienter utvecklar permanenta symtom efter exponering för stress. Denna förmodade gen-miljö interaktion är fortfarande inte väl förstått, men kan utgöra en av de viktigaste pathomechanisms i DYT/PARK-ATP1A3 utveckling. Olika metoder för att utsätta möss för stress har publicerats i det förflutna och inkluderar elektriska fotstötar, fasthållande, kall eller varm miljö och exponering för olikalukter 11,12,13. I ett försök att exponera möss för en mild stressfaktor med translationellt värde beskriver vi här mössens repetitiva undersã¤ttning till utmanande motoriska uppgifter. För poltestet avslöjade ouabain-perfused djur ofrivillig hyperextension av främre lemmar och bakben. Dessa rörelser var mycket lika de dystoni-liknande rörelser som observerats under 4-min videoinspelning av djuren samt svans suspension test. Tillämpningen av mild stress i form av utmanande motoriska uppgifter kan visa sig användbart i andra musmodeller som visar motoriska symtom eller neurodegeneration, där gen-miljömässiga interaktioner kraftigt påverkar graden av sjukdomsprogression.
Det finns en allmän brist på fördefinierade beteendemässiga uppgifter samt betygsskalor för att klassificera onormala rörelser och ställningar hos möss. De flesta av de tillgängliga motoruppgifter avslöja ospecifika avvikelser, såsom hindlimb knäppning, som är ett välkänt fenomen i många mus modeller av rörelsestörningar med neurodegeneration18,19. För den rätta karakteriseringen av en fenotyp är det dock nödvändigt att analysera om musmodellen rekapitulerar sjukdomens framträdande egenskaper. Häri presenterar vi den modifierade versionen av en dystoni rating skala som tidigare använts för bedömning av motoriska funktionshinder i dystoni mus modeller15,16. Vi utvecklade dessutom en observatör-baserade poängsystem för svansen suspension test, som fastställdes på liknande sätt till de kliniska rating skalor av mänskliga dystoni. Båda betygsskalorna visar en betydligt högre poäng i ouabain-perfused, stressade möss jämfört med ouabain-perfused, icke-stressade djur samt fordon-perfused djur. Nackdelarna med alla observatörsbaserade poängsystem är den utbildning som krävs av bedömare för att säkerställa en konsekvent poängsättning och för att minska observatörsvariabiliteten samt risken för en eventuell bias av bedömaren om den inte är helt förblindad för den analyserade gruppen. Observatörsbaserade poängsystem presenterar dock fortfarande en lättillgänglig metod för att karakterisera en fenotyp och kan anpassas till den musmodell som analyseras, vilket görs i det föreliggande projektet för bedömning av dystoniliknande rörelser. För att säkerställa konsekvent poängsättning bland olika raters, utbildning videor bör göras tillgängliga. För att minska eventuella bias, rekommenderas att olika raters poäng samma videoklipp och att de enskilda poängen är i genomsnitt. Båda poängsystem som nämns inom detta arbete registrera förekomsten av dystoni-liknande rörelser hos djur. Betygskalorna kan anpassas enligt de särskilda kraven inom ett projekt, som tidigare gjorts av Ip et al., där enbart bakfoterna poängserades för dystoniliknande rörelser i en musmodell för dystoni 1 (DYT-TOR1A)20. Betygskalorna kan kompletteras med andra tidigare publicerade poängsystem, och bedöma till exempel graden av bradykinesi hos gnagare som gjort med förflyttningshandvissan av Calderon et al.13.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF DysTract till C.W.I.) och av tvärvetenskapligt Center for Clinical Research (IZKF) vid universitetet i Würzburg (Z2-CSP3 till L.R.). Författarna tackar Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger och Heike Menzel och för deras tekniska hjälp samt Helga Brünner för djurvården.
0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
Bulldog Clamps | Agntho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
Cannula and Minipump Holder | Stoelting | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting | 56109M | |
Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
Octenisept | Schülke | 118211 | |
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
Rectal Thermal Probe | Stoelting | 50304 | |
Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting | 53800M | |
RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
screw driver set | Agntho's | 30090-6 | |
Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
StereoDrive | Neurostar | software | |
Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
Stereotaxic robot | Neurostar | ||
suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |