استكشاف بنية الأنسجة الدهنية من ميثيل ساليسيلات المقاصة والتصوير ثلاثي الأبعاد
Summary
هنا، ونحن وصف طريقة بسيطة وغير مكلفة وسريعة المقاصة لحل هيكل 3D من كل من الماوس والبشر الأبيض الدهني باستخدام مزيج من علامات لتصور الأوعية الدموية، والنوى، والخلايا المناعية، والخلايا العصبية، والبروتينات معطف قطرات الدهون عن طريق التصوير الفلورسنت.
Abstract
السمنة هي قضية الصحة العامة الرئيسية في جميع أنحاء العالم التي تزيد من خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية، والسكري من النوع 2، وأمراض الكبد. تتميز السمنة بزيادة في الأنسجة الدهنية (AT) كتلة بسبب فرط التنسج الدهني و / أو الفرط في التروبيه، مما يؤدي إلى إعادة عرض عميقة لهيكلها ثلاثي الأبعاد. في الواقع ، فإن القدرة القصوى لـ AT على التوسع أثناء السمنة أمر محوري لتطوير الأمراض المرتبطة بالسمنة. هذا التوسع AT هو آلية هامة المثلية لتمكين التكيف مع زيادة كمية الطاقة وتجنب الآثار الضارة للدهون إلى الأجهزة الأيضية الأخرى, مثل العضلات والكبد. ولذلك، فهم إعادة البناء الهيكلية التي تؤدي إلى فشل التوسع AT هو مسألة أساسية مع تطبيق السريرية عالية. في هذه المقالة، نحن وصف طريقة بسيطة وسريعة المقاصة التي تستخدم بشكل روتيني في مختبرنا لاستكشاف مورفولوجيا الماوس والبشر الأبيض الدهني الأنسجة عن طريق التصوير الفلورسنت. يتم تنفيذ طريقة إزالة AT المحسنة هذه بسهولة في أي مختبر قياسي مجهز بغطاء كيميائي، وشاكر مداري يتم التحكم فيه بدرجة الحرارة ومجهر فلوري. وعلاوة على ذلك، فإن المركبات الكيميائية المستخدمة متاحة بسهولة. الأهم من ذلك، هذه الطريقة تسمح لأحد لحل هيكل AT 3D عن طريق تلطيخ علامات مختلفة لتصور على وجه التحديد adipocytes، والشبكات العصبية والأوعية الدموية، وتوزيع الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية.
Introduction
وتتميز السمنة بزيادة في كتلة الأنسجة الدهنية وأصبحت قضية رئيسية في مجال الصحة العامة في جميع أنحاء العالم، بالنظر إلى أن الأشخاص الذين يعانون من السمنة لديهم خطر متزايد للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية، والسكري من النوع 2، وأمراض الكبد وبعض أنواع السرطان.
وظيفة فسيولوجية أساسية من الأنسجة الدهنية هو تعديل الجلوكوز في الجسم كله والدهون التوازن1,2. خلال فترة التغذية، يخزن الخلايا الشحمية (أي الخلايا الرئيسية للأنسجة الدهنية) الفائض من الجلوكوز والدهون التي توفرها وجبة في الدهون الثلاثية. أثناء الصيام ، تقوم الخلايا الشحمية بتكسير الدهون الثلاثية إلى أحماض دهنية غير مُهجنة وغليسيرول للحفاظ على الطلب على الطاقة في الجسم. خلال تطور السمنة، يوسع النسيج الدهني عن طريق زيادة حجم (الضخام) و /أو عدد (فرط تنسج) من الخلايا الشحمية1، لزيادة قدرتها التخزينية. عندما يصل توسع الأنسجة الدهنية إلى حده الأقصى، وهو متغير ثابت للغاية بين المرضى، تتراكم الدهون المتبقية في الأجهزة الأيضية الأخرى بما في ذلك العضلات والكبد3،4، مما يؤدي إلى فشلها الوظيفي وبدء مضاعفات القلب والتمثيل الغذائي المرتبطة بالسمنة1،5. ولذلك، فإن تحديد الآليات التي تحكم توسع الأنسجة الدهنية هو تحد سريري رئيسي.
ترتبط التعديلات المورفولوجية الموثقة داخل الأنسجة الدهنية أثناء السمنة بخللها المرضي. وقد استخدمت العديد من إجراءات تلطيخ لوصف تنظيم الأنسجة من الأنسجة الدهنية، بما في ذلك actin6، علامات الأوعية الدموية7، علامات قطرات الدهون8، وعلامات محددة الخلايا المناعية9،10. ومع ذلك، بسبب القطر الضخم من adipocytes (50 إلى 200 ميكرومتر)11، فمن الضروري لتحليل جزء كبير من الأنسجة كلها في ثلاثة أبعاد من أجل تحليل دقيق التغيرات DRAMATIC AT الهيكلية لاحظت أثناء السمنة. ومع ذلك، لأن الضوء لا يخترق نسيجًا مبهمًا، فإن التصوير ثلاثي الأبعاد داخل عينات الأنسجة الكبيرة باستخدام المجهر الفلوري غير ممكن. وقد تم الإبلاغ عن طرق تطهير الأنسجة لجعلها شفافة في الأدبيات (للمراجعة ، انظر12)مما يسمح للمرء بمسح الأنسجة وإجراء مجهر مجهري فلورانس الأنسجة بالكامل. هذه الأساليب توفر فرصا غير مسبوقة لتقييم التنظيم الخلوي 3D في الأنسجة الصحية والمامراضة. كل من الطرق الموصوفة لها مزايا وعيوب، وبالتالي تحتاج إلى أن يتم اختيار بعناية اعتمادا على الأنسجة درس (لاستعراض، انظر13). في الواقع، تتطلب بعض الأساليب فترة حضانة طويلة و / أو استخدام المواد أو المركبات التي هي إما مكلفة أو سامة أو يصعب الحصول على14،15،16،17،18،19. الاستفادة من واحدة من أول المركبات المستخدمة قبل قرن من قبل فيرنر Spalteholz لمسح الأنسجة20، وضعنا بروتوكول سهل الاستعمال وغير مكلفة التي هي مكيفة بشكل جيد جدا لتطهير جميع الماوس ومستودعات الأنسجة الدهنية البشرية في أي مختبر مع معدات نموذجية بما في ذلك غطاء محرك السيارة الكيميائية ، وشاكر المداري درجة الحرارة التي تسيطر عليها والمجهر confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعديلات التي تحدث داخل الأنسجة الدهنية على مدى التقدم المرضي ، مثل السمنة ، أمر أساسي لفهم الآليات وراء علم الأمراض. وقد استندت الدراسات الرائدة التي كشفت عن هذه الآليات في الأنسجة الدهنية على المقاربات العالمية مثل بروتيوميكس الأنسجة الدهنية21، تدفق الخلايا22…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل INSERM، جامعة كوت دازور، وبمنح من الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR) من خلال الاستثمارات في المستقبل لابكس SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01)، وبرنامج UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) عبر الأكاديمية 2 “مجمعات Systèmes” وأكاديمية 4 “Complexité eté التنوع du vivant”, مؤسسة من أجل الـ Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587)، وبرنامج المحققين الشباب إلى J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). كما نشكر مرفق التصوير الأساسي لـ C3M الذي يموله مجلس إدارة ألب- ماريتام و Région PACA، والذي تدعمه أيضًا منصة المجهر والتصوير IBISA Côte d’Azur (MICA). نشكر ماريون دوسوت على المساعدة التقنية في إعداد الأنسجة. نشكر آبي كوتريسس، الرؤية العلمية الدولية في جامعة UCA، على قراءة المخطوطة كدليل.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
Riferimenti
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W., Hierzel, S. . Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. , (1911).
- Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
