Udforskning af fedtvævsstruktur ved methylsalicylatclearing og 3D-billeddannelse
Summary
Her beskriver vi en enkel, billig og hurtig clearing metode til at løse 3D-strukturen af både mus og humanhvidt fedtvæv ved hjælp af en kombination af markører til at visualisere vaskulatur, kerner, immunceller, neuroner, og lipid-dråbe pels proteiner ved fluorescerende billeddannelse.
Abstract
Fedme er et stort verdensomspændende folkesundhedsproblem, der øger risikoen for at udvikle hjerte-kar-sygdomme, type-2 diabetes, og leversygdomme. Fedme er karakteriseret ved en stigning i fedtvæv (AT) masse på grund af adipocyt hyperplasi og / eller hypertrophia, fører til dybtgående remodeling af sin tre-dimensionelle struktur. Faktisk er AT’s maksimale evne til at ekspandere under fedme afgørende for udviklingen af fedme-associerede patologier. Denne AT ekspansion er en vigtig homeostatisk mekanisme til at muliggøre tilpasning til et overskud af energiindtag og for at undgå skadelige lipid spillover til andre metaboliske organer, såsom muskler og lever. Derfor er forståelse af den strukturelle remodeling, der fører til svigt af AT ekspansion et grundlæggende spørgsmål med høj klinisk anvendelighed. I denne artikel beskriver vi en enkel og hurtig clearing metode, der rutinemæssigt anvendes i vores laboratorium til at udforske morfologi af mus og humant hvidt fedtvæv ved fluorescerende billeddannelse. Denne optimerede AT-clearingmetode udføres nemt i ethvert standardlaboratorium, der er udstyret med en kemisk hætte, en temperaturstyret orbitalshaker og et fluorescerende mikroskop. Desuden er de anvendte kemiske forbindelser let tilgængelige. Vigtigere er det, denne metode gør det muligt at løse 3D AT struktur ved farvning forskellige markører til specifikt visualisere adipocytter, neuronal og vaskulære netværk, og den medfødte og adaptive immunceller fordeling.
Introduction
Fedme er karakteriseret ved en stigning i fedtvæv masse og er blevet et stort verdensomspændende folkesundhedsproblem, da mennesker med fedme har øget risiko for at udvikle hjerte-kar-sygdom, type-2 diabetes, leversygdomme og nogle kræftformer.
En grundlæggende fysiologisk funktion af fedtvæv er at modulere helkropsglukose og lipidhomøostase1,2. I fodringsperioden opbevarer adipocytterne (dvs. de vigtigste celler i fedtvævet) det overskydende glukose og lipider, som et måltid leverer, til triglycerider. Under fastende, adipocytter nedbryde triglycerider i ikke-esterificerede fedtsyrer og glycerol at opretholde energibehovet i kroppen. Under udviklingen af fedme, fedtvæv udvide ved at øge størrelsen (hypertrophia) og / eller antallet (hyperplasi) af adipocytes1, at øge deres lagerkapacitet. Når udvidelsen af fedtvæv når sin grænse, en konstant meget varierende blandt patienter, de resterende lipider ophobes i andre metaboliskeorganer,herunder muskler oglever 3,4, fører til deres funktionelle svigt og indlede fedme-relaterede cardio-metaboliskekomplikationer 1,5. Derfor, identificere de mekanismer, der styrer fedtvæv ekspansion er en vigtig klinisk udfordring.
De morfologiske ændringer dokumenteret i fedtvæv under fedme er knyttet til dens patologiske dysfunktion. Flere farvning procedurer er blevet brugt til at beskrive væv organisation af fedtvæv, herunder actin6, vaskulæremarkører 7, lipid-dråbemarkører 8, og specifikke immuncelle markører9,10. Men på grund af den enorme diameter af adipocytter (50 til 200 μm)11, er det vigtigt at analysere en stor del af hele vævet i tre dimensioner for præcist at analysere de dramatiske strukturelle AT ændringer observeret under fedme. Men da lyset ikke trænger ind i et uigennemsigtigt væv, er billeddannelse i 3D i en stor vævsprøver ved hjælp af fluorescensmikroskopi ikke mulig. Metoder til vævsclearing for at gøre dem gennemsigtige er blevet rapporteret i litteraturen (til gennemgang, se12), så man kan rydde væv og udføre dybdegående, hele vævfluorescensmikroskopi. Disse metoder giver hidtil usete muligheder for at vurdere 3D cellulære organisation i sundt og syge væv. Hver af de beskrevne metoder har fordele og ulemper, og derfor skal nøje vælges afhængigt af det undersøgte væv (for en gennemgang, se13). Nogle metoder kræver faktisk en lang inkubationstid og/eller anvendelse af materialer eller forbindelser , der enten er dyre , giftige eller vanskelige atopnå 14,15,16,17,18,19. Drage fordel af en af de første forbindelser, der anvendes et århundrede siden af Werner Spalteholz at rydde væv20, vi oprettet en brugervenlig og billig protokol, der er meget velegnet til clearing af alle mus og menneskelige fedtvæv depoter i ethvert laboratorium med typisk udstyr, herunder en kemisk hætte, en temperatur-kontrolleret orbital shaker og en konfokal mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ændringer, der opstår inden for fedtvævet i løbet af patologisk progression, såsom fedme, er afgørende for forståelsen af mekanismerne bag patologien. Banebrydende undersøgelser, der afslørede sådanne mekanismer i fedtvæv har været baseret på globale tilgange såsom hele fedtvæv proteomics21, flow cytometri22,23, og transskriptomics24,25. Desuden er der gjort en in…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af INSERM, Université Côte d’Azur, og ved tilskud fra det franske nationale forskningsagentur (ANR) gennem investeringer for fremtiden Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programmet UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 “Systèmes Complexes” og Academy 4 “Complexité et diversité du vivant”, Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587) og Young Investigator Program to J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Vi takker også Imaging Core Facility i C3M, der finansieres af Conseil Départemental des Alpes-Maritimes og Région PACA, og som også støttes af IBISA-mikrokopi- og billedplatformen Côte d’Azur (MICA). Vi takker Marion Dussot for teknisk hjælp i vævspræparat. Vi takker Abby Cuttriss, UCA International Videnskabelig synlighed, for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
Riferimenti
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W., Hierzel, S. . Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. , (1911).
- Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
