Explorando estrutura tecidual adiposa por limpeza de metilsalicylate e imagem 3D
Summary
Aqui, descrevemos um método simples, barato e rápido de limpeza para resolver a estrutura 3D do tecido adiposo branco e camundongo usando uma combinação de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células imunes, neurônios e proteínas de casaco de gotícula lipídica por imagem fluorescente.
Abstract
A obesidade é um grande problema de saúde pública mundial que aumenta o risco de desenvolver doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2 e doenças hepáticas. A obesidade é caracterizada pelo aumento da massa do tecido adiposo (AT) devido à hiperplasia adipócito e/ou hipertrofia, levando à profunda remodelação de sua estrutura tridimensional. De fato, a capacidade máxima de expansão da AT durante a obesidade é fundamental para o desenvolvimento de patologias associadas à obesidade. Esta expansão AT é um importante mecanismo homeostático para permitir a adaptação a um excesso de ingestão de energia e evitar o derramamento de lipídio deletério para outros órgãos metabólicos, como músculo e fígado. Portanto, compreender a remodelagem estrutural que leva ao fracasso da expansão at é uma questão fundamental com alta aplicabilidade clínica. Neste artigo, descrevemos um método simples e rápido de limpeza que é usado rotineiramente em nosso laboratório para explorar a morfologia do tecido adiposo branco e camundongo por imagem fluorescente. Este método otimizado de limpeza AT é facilmente realizado em qualquer laboratório padrão equipado com uma capa química, um agitador orbital controlado pela temperatura e um microscópio fluorescente. Além disso, os compostos químicos utilizados estão prontamente disponíveis. É importante ressaltar que este método permite resolver a estrutura 3D AT, colorindo vários marcadores para visualizar especificamente os adipócitos, as redes neuronais e vasculares e a distribuição de células imunes inatas e adaptáveis.
Introduction
A obesidade é caracterizada pelo aumento da massa tecidual adiposa e tornou-se um grande problema de saúde pública mundial, uma vez que as pessoas com obesidade têm risco aumentado de desenvolver doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, doenças hepáticas e alguns cânceres.
Uma função fisiológica fundamental do tecido adiposo é modular a glicose do corpo inteiro e a homeostase lipídica1,2. Durante o período de alimentação, os adipócitos (ou seja, as principais células do tecido adiposo) armazenam o excesso de glicose e lipídios fornecidos por uma refeição em triglicérides. Durante o jejum, os adipócitos dividem os triglicérides em ácidos graxos não esterificados e glicerol para sustentar a demanda energética do corpo. Durante o desenvolvimento da obesidade, o tecido adiposo expande-se aumentando o tamanho (hipertrophia) e/ou o número (hiperplasia) dos adipócitos1, para aumentar sua capacidade de armazenamento. Quando a expansão do tecido adiposo atinge seu limite, uma constante altamente variável entre os pacientes, os lipídios restantes se acumulam em outros órgãos metabólicos, incluindo músculos e fígado3,,4, levando à sua falha funcional e iniciando complicações cardio-metabólicas relacionadas à obesidade1,,5. Portanto, identificar os mecanismos que regem a expansão do tecido adiposo é um desafio clínico fundamental.
As modificações morfológicas documentadas dentro dos tecidos adiposos durante a obesidade estão ligadas à sua disfunção patológica. Vários procedimentos de coloração têm sido utilizados para descrever a organização tecidual do tecido adiposo, incluindo actin6, marcadores vasculares7,marcadores lipídes-gotículas8, e marcadores de células imunes específicas9,,10. No entanto, devido ao enorme diâmetro dos adipócitos (50 a 200 μm)11, é essencial analisar grande parte de todo o tecido em três dimensões, a fim de analisar com precisão as dramáticas mudanças estruturais de AT observadas durante a obesidade. No entanto, como a luz não penetra em um tecido opaco, não é possível imagens em 3D dentro de uma grande amostra de tecido usando microscopia de fluorescência. Métodos de limpeza tecidual para torná-los transparentes têm sido relatados na literatura (para uma revisão, ver12) permitindo que se limpe tecidos e realize microscopia de fluorescência tecidual. Esses métodos oferecem oportunidades sem precedentes para avaliar a organização celular 3D em tecido saudável e doente. Cada um dos métodos descritos tem vantagens e desvantagens e, portanto, precisa ser cuidadosamente selecionado dependendo do tecido estudado (para uma revisão, veja13). De fato, algumas abordagens requerem um longo período de incubação e/ou o uso de materiais ou compostos que sejam caros, tóxicos ou difíceis de obter14,15,16,17,,18,19. Aproveitando um dos primeiros compostos usados há um século por Werner Spalteholz para limpar tecidos20,criamos um protocolo fácil de usar e barato que é muito bem adaptado para a limpeza de todos os depósitos de tecido adiposo humano e camundongos em qualquer laboratório com equipamento típico, incluindo um capuz químico, um agitador orbital controlado pela temperatura e um microscópio confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
As modificações que ocorrem dentro do tecido adiposo ao longo da progressão patológica, como a da obesidade, são fundamentais para a compreensão dos mecanismos por trás da patologia. Estudos pioneiros que revelaram tais mecanismos no tecido adiposo têm sido baseados em abordagens globais como proteômica de tecido adiposo inteiro21,citometria de fluxo22,,23e transcriômica24,25</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho contou com o apoio da INSERM, Université Côte d’Azur, e por subsídios da Agência Nacional de Pesquisa francesa (ANR) através dos Investimentos para o Futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), o programa UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 “Systèmes Complexes ” e Academy 4 “Complexité et diversité du vivant”, Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), e o Programa Jovem Investigador para J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Agradecemos também a Instalação núcleo de imagem do C3M financiada pelo Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e pelo Région PACA, e que também conta com o apoio da Plataforma de Microscopia e Imagem IBISA Côte d’Azur (MICA). Agradecemos a Marion Dussot por ajuda técnica na preparação de tecidos. Agradecemos a Abby Cuttriss, visibilidade científica internacional da UCA, pela leitura do manuscrito.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
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