Burada, hem fare hem de insan beyaz yağ dokusunun 3Boyutlu yapısını çözüme kavuşturmak için basit, ucuz ve hızlı bir temizleme yöntemi tanımlıyoruz.
Obezite kardiyovasküler hastalıklar, tip-2 diyabet ve karaciğer hastalıkları geliştirmek için risk artar önemli bir dünya çapında halk sağlığı sorunudur. Obezite, adiposit hiperplazi ve/veya hipertrophiye bağlı yağ dokusu (AT) kütlesindeki artış ile karakterizedir ve üç boyutlu yapısının derin bir şekilde yenilenmesine yol açar. Gerçekten de, obezite sırasında genişletmek için AT maksimal kapasitesi obezite ile ilişkili patolojilerin gelişimi için çok önemlidir. Bu AT genişleme ve enerji alımının aşırı adaptasyon sağlamak için önemli bir homeostatik mekanizma diğer metabolik organlara zararlı lipid dökülmesini önlemek için, kas ve karaciğer gibi. Bu nedenle, AT genişlemesinin başarısızlığına yol açan yapısal yeniden şekillendirmenin anlaşılması, yüksek klinik uygulanabilirliği olan temel bir sorudur. Bu makalede, floresan görüntüleme ile fare ve insan beyaz yağ dokusunun morfolojisini keşfetmek için rutin olarak laboratuarımızda kullanılan basit ve hızlı bir temizleme yöntemini açıklıyoruz. Bu optimize AT temizleme yöntemi kolayca bir kimyasal başlık, sıcaklık kontrollü orbital shaker ve floresan mikroskop ile donatılmış herhangi bir standart laboratuvarda gerçekleştirilir. Ayrıca, kullanılan kimyasal bileşikler kolayca kullanılabilir. Daha da önemlisi, bu yöntem özellikle adipositler, nöronal ve vasküler ağlar ve doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücreleri dağılımı görselleştirmek için çeşitli belirteçleri boyama tarafından 3D AT yapısını çözmek için izin verir.
Obezite yağ dokusu kütlesinde bir artış ile karakterizedir ve önemli bir dünya çapında halk sağlığı sorunu haline gelmiştir, obezite olan kişilerin kardiyovasküler hastalık gelişme riskini artırdığı göz önüne alındığında, tip-2 diyabet, karaciğer hastalıkları ve bazı kanserler.
Yağ dokusunun temel fizyolojik fonksiyonu tüm vücut glikoz ve lipid homeostazı modüle etmektir1,2. Beslenme döneminde, adipositler (yani, yağ dokusunun ana hücreleri) trigliserid içine bir yemek tarafından sağlanan glikoz ve lipidlerin aşırı depolar. Oruç sırasında, adipositler vücudun enerji talebini sürdürmek için esterleştirilmiş olmayan yağ asitleri ve gliserol içine trigliserid yıkmak. Obezite gelişimi sırasında, yağ dokusu büyüklüğü artırarak genişletmek (hipertrophi) ve / veya sayı (hiperplazi) adipositler1, depolama kapasitesini artırmak için. Yağ dokusunun genişlemesi sınırına ulaştığında, hastalar arasında sürekli bir son derece değişken, kalan lipidler kas ve karaciğer 3 dahil olmak üzere diğer metabolik organlara birikir3,4, fonksiyonel yetmezliğine yol açan ve obezite ile ilgili kardiyo-metabolik komplikasyonlar başlatılması1,5. Bu nedenle, yağ dokusu genişlemesi yöneten mekanizmaların belirlenmesi önemli bir klinik sorundur.
Obezite sırasında yağ dokularında belgelenen morfolojik modifikasyonlar patolojik disfonksiyonu ile bağlantılıdır. Çeşitli boyama prosedürleri adipoz doku organizasyonu tanımlamak için kullanılmıştır, aktin dahil6, vasküler belirteçleri7, lipid damlacık belirteçleri8, ve spesifik bağışıklık hücre belirteçleri9,10. Ancak, adipositlerin büyük çapı nedeniyle (50-200 μm)11, obezite sırasında gözlenen dramatik yapısal AT değişiklikleri doğru analiz etmek için üç boyutlu tüm doku büyük bir bölümünü analiz etmek esastır. Ancak, ışık opak bir doku nüfuz etmez çünkü, floresan mikroskopi kullanarak büyük bir doku örnekleri içinde 3D görüntüleme mümkün değildir. Doku temizleme yöntemleri onları şeffaf hale getirmek için literatürde bildirilmiştir (bir inceleme için, bakınız12) dokuları temizlemek ve derinlemesine gerçekleştirmek için izin, tüm doku floresan mikroskopi. Bu yöntemler sağlıklı ve hastalıklı dokuda 3D hücresel organizasyonu değerlendirmek için benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Açıklanan yöntemlerin her birinin avantajları ve dezavantajları vardır ve bu nedenle incelenen dokuya bağlı olarak dikkatle seçilmesi gerekir (gözden geçirme içinbkz. 13). Nitekim, bazı yaklaşımlar uzun bir kuluçka dönemi ve / veya pahalı, toksik ya da 14,15,16,,17,18,19elde etmek zor malzeme veya bileşiklerin kullanımını gerektirir.19 Bir yüzyıl önce Werner Spalteholz tarafından dokuları temizlemek için kullanılan ilk bileşiklerden birinden yararlanarak20, biz çok iyi bir kimyasal başlık, bir sıcaklık kontrollü orbital shaker ve konfokal mikroskop da dahil olmak üzere tipik ekipman ile herhangi bir laboratuvarda tüm fare ve insan yağ dokusu depolarının temizlenmesi için uyarlanmış bir kullanıcı dostu ve ucuz protokol kurmak.
Obezite gibi patolojik ilerleme boyunca yağ dokusu içinde meydana gelen değişiklikler, patolojinin arkasındaki mekanizmaların anlaşılmasında temel dir. Yağ dokusunda bu tür mekanizmaları ortaya öncü çalışmalar gibi tüm yağ dokusu proteomics21gibi küresel yaklaşımlara dayalı olmuştur , akış sitometri22,23, ve transkripsiyon24,25. Buna ek olarak, histolojik …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma INSERM tarafından desteklenmiştir, Université Côte d’Azur ve Gelecek Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), program UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) Akademi 2 “Systèmes Complexes” ve Akademi 4 “Complexité dalgıç etsité ant revivant du”, için Yatırımlar aracılığıyla Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) hibeleri ile, Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587) ve J.G.’ye Genç Araştırmacı Programı (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Ayrıca Conseil Départemental des Alpes-Maritimes ve Région PACA tarafından finanse edilen ve IBISA Mikroskobu ve Görüntüleme Platformu Côte d’Azur (MICA) tarafından desteklenen C3M’nin Görüntüleme Çekirdek Tesisine de teşekkür ederiz. Marion Dussot’a doku hazırlığında teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz Abby Cuttriss, UCA Uluslararası Bilimsel Görünürlük, makalenin kanıt okuma için teşekkür ederiz.
1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |