Detección de variantes genéticas en el gen CALR mediante análisis de fusión de alta resolución

Summary

El análisis de fusión de alta resolución (HRM) es una solución sensible y rápida para la detección de variantes genéticas. Depende de las diferencias de secuencia que dan lugar a heterodúplex que cambian la forma de la curva de fusión. Al peinar la HRM y la electroforesis en gel de agarosa, se pueden identificar diferentes tipos de variantes genéticas como los indels.

Abstract

El análisis de fusión de alta resolución (HRM) es un método poderoso para el genotipado y el escaneo de variación genética. La mayoría de las aplicaciones de HRM dependen de colorantes de ADN saturados que detectan diferencias de secuencia y heterodúplex que cambian la forma de la curva de fusión. Se necesita una excelente resolución del instrumento y un software especial de análisis de datos para identificar las pequeñas diferencias de la curva de fusión que identifican una variante o genotipo. Se pueden observar diferentes tipos de variantes genéticas con diversas frecuencias en el gen específico para pacientes con una enfermedad específica, especialmente cáncer y en el gen CALR en pacientes con neoplasias mieloproliferativas negativas para el cromosoma Filadelfia. Los cambios de nucleótido único, las inserciones y/o deleciones (indels) en el gen de interés pueden ser detectados por el análisis HRM. La identificación de diferentes tipos de variantes genéticas se basa principalmente en los controles utilizados en el ensayo qPCR HRM. Sin embargo, a medida que aumenta la longitud del producto, la diferencia entre las curvas de tipo salvaje y heterocigoto se hace más pequeña, y el tipo de variante genética es más difícil de determinar. Por lo tanto, cuando los indels son la variante genética prevalente esperada en el gen de interés, se puede utilizar un método adicional como la electroforesis en gel de agarosa para la aclaración del resultado de la HRM. En algunos casos, un resultado no concluyente debe volver a verificarse/volver a diagnosticarse mediante la secuenciación estándar de Sanger. En este estudio retrospectivo, aplicamos el método a pacientes JAK2 V617F negativos con MPN.

Introduction

Las variantes genéticas somáticas en el gen de la calreticulina(CALR)fueron reconocidas en 2013 en pacientes con neoplasias mieloproliferativas (MPN) como trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria^1,2. Desde entonces, se han descubierto más de 50 variantes genéticas en el gen CALR, induciendo un desplazamiento de marco +1 (−1+2)³. Las dos variantes genéticas CALR más frecuentes son una deleción de 52 pb (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), también llamada mutación tipo 1, y una inserción de 5 pb (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), también llamada mutación tipo 2. Estas dos variantes genéticas representan el 80% de todas las variantes genéticas de CALR. Los otros se han clasificado como tipo 1 o tipo 2 utilizando algoritmos basados en la preservación de una hélice α cercana al tipo salvaje CALR^4. Aquí, presentamos uno de los métodos altamente sensibles y rápidos para la detección de variantes genéticas CALR, el método de análisis de fusión de alta resolución (HRM). Este método permite la detección rápida de variantes genéticas tipo 1 y tipo 2, que representan la mayoría de las mutaciones CALR ⁵. HrM se introdujo en combinación con la »reacción en cadena de la polimerasa« en tiempo real (qPCR) en 1997 como una herramienta para detectar la mutación en el factor V Leiden^6. En comparación con la secuenciación de Sanger que representa la técnica estándar de oro, la HRM es un método más sensible y menos específico⁵. El método HRM es un buen método de cribado que permite un análisis rápido de un gran número de muestras con un gran coste-beneficio⁵. Es un método de PCR simple realizado en presencia de un tinte fluorescente y no requiere habilidades específicas. Otro beneficio es que el procedimiento en sí no daña ni destruye la muestra analizada que nos permite reutilizar la muestra para electroforesis o secuenciación de Sanger después del procedimiento HRM⁷. La única desventaja es que a veces es difícil interpretar los resultados. Además, la HRM no detecta la mutación exacta en pacientes con mutaciones no tipo 1 o tipo 2^8. En estos pacientes, se debe realizar la secuenciación de Sanger (Figura 1).

La HRM se basa en la amplificación de la región específica del ADN en presencia de un colorante fluorescente de ADN saturado, que se incorpora en el ADN de doble cadena (dsDNA). El colorante fluorescente emite luz cuando se incorpora en el dsDNA. Después de un aumento progresivo de la temperatura, el dsDNA se descompone en ADN monocatenario, que se puede detectar en la curva de fusión como una disminución repentina en la intensidad de la fluorescencia. La forma de la curva de fusión depende de la secuencia de ADN que se utiliza para detectar la mutación. Las curvas de fusión de las muestras se comparan con las curvas de fusión de mutaciones conocidas o CALR de tipo salvaje. Las curvas de fusión distintas representan una mutación diferente que no es tipo 1 o tipo 2^9.

El algoritmo para la detección de variantes genéticas somáticas en el gen CALR mediante HRM, electroforesis en gel de agarosa y método de secuenciación(Figura 1)fue utilizado y validado en el estudio retrospectivo publicado antes^{del 10.}

Protocol

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica de la República de Eslovenia. Todos los procedimientos se ajustaban a la declaración de Helsinki. 1. PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia (qPCR) y análisis post-qPCR por HRM Imprimaciones resuspend enumeradas en la Tabla de Materiales a 100 μM con H2O estéril, RNasa y Libre de DNasa (ver Tabla de Materiales). Haga una imprimación de concentración de trabajo …

Representative Results

La región de interés del ADN amplificada con éxito con un aumento exponencial de la fluorescencia que supera el umbral entre los ciclos 15 y 35 y valores muy estrechos del ciclo de cuantificación (Cq) en todas las muestras y controles replicados(Figura 2)es un requisito previo para la identificación fiable de variantes genéticas mediante análisis HRM. Esto se logra mediante el uso de una determinación precisa de ADN con tinción de fluorescencia y una cantidad igual de ADN en el expe…

Discussion

La fusión de ADN de alta resolución es una solución simple para el genotipado y el escaneo de variantes genéticas¹⁴. Depende de las diferencias de secuencia que dan lugar a heterodúplex que cambian la forma de la curva de fusión. Se pueden observar diferentes tipos de variantes genéticas con diversas frecuencias en el gen específico para un determinado grupo de pacientes con cáncer^{1,2,15,</s…}

Materials

E-Gel EX 4% Agarose	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp Optical adhesive film	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit	QIAGEN	51306	DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
QUBIT dsDNA HS assay	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
Water nuclease free	VWR, Life Science	436912C	RNase, DNase and Protease free water