إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9
Summary
يستخدم CRISPR/Cas9 بشكل متزايد لتوصيف وظيفة الجينات في الكائنات غير النموذجية. يصف هذا البروتوكول كيفية توليد خطوط خروج المغلوب من Culex pipiens، من إعداد خلطات الحقن ، إلى الحصول على أجنة البعوض وحقنها ، وكذلك كيفية تربية البعوض المحقون وعبوره وفحصه وذريه للطفرات المطلوبة.
Abstract
البعوض Culex هي النواقل الرئيسية للعديد من الأمراض التي تؤثر سلبا على صحة الإنسان والحيوان بما في ذلك فيروس غرب النيل والأمراض الناجمة عن الديدان الخيطية مثل دودة القلب الناب وداء الفيلة. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام تحرير الجينوم CRISPR /Cas9 للحث على الطفرات الموجهة إلى الموقع عن طريق حقن بروتين Cas9 الذي تم تعقيده مع الحمض النووي الريبي (gRNA) في الأجنة الطازجة من عدة أنواع من الحشرات ، بما في ذلك البعوض الذي ينتمي إلى جنس Anopheles و Aedes. إن التلاعب بعوض Culex وحقنه أكثر صعوبة قليلا لأن هذه البعوض تضع بيضها منتصبا في الطوافات بدلا من وضعها بشكل فردي مثل الأنواع الأخرى من البعوض. هنا نصف كيفية تصميم الحمض النووي الريبي ، وتعقيدها مع بروتين Cas9 ، وحمل البعوض الأنثوي من Culex pipiens على وضع البيض ، وكيفية إعداد وحقن الأجنة الموضوعة حديثا للتشخيص الدقيق مع Cas9 / gRNA. كما نقوم بوصف كيفية إعادة فحص البعوض المحقون وفحصه للكشف عن الطفرة المرغوبة. وتبين النتائج التمثيلية أن هذه التقنية يمكن استخدامها للحث على حدوث طفرات موجهة نحو الموقع في جينوم بعوض كوليكس، ويمكن استخدامها، مع تعديلات طفيفة، لتوليد طفرات فارغة في أنواع البعوض الأخرى أيضا.
Introduction
يتم توزيع البعوض Culex في جميع أنحاء المناطق المعتدلة والاستوائية في العالم وينقل العديد من الفيروسات القاتلة بما في ذلك فيروس غرب النيل1، التهاب الدماغ سانت لويس2 وكذلك الديدان الخيطية التي تسبب دودة القلب ال3 وداءالفيلة 4. أعضاء مجمع Culex pipiens ، الذي يتضمن Cx. quinquefasciatus، Cx. pipiens pipiens و Cx. pipiens molestus، يظهرون اختلافات مذهلة في العديد من جوانب بيولوجيتهم. على سبيل المثال، في حين Cx. quinquefasciatus وCx. pipiens molestus غير قادرين على دخول نائمة overwintering5،6، Cx. pipiens pipiens عرض استجابات موسمية قوية وأدخل diapause ردا على أيام قصيرة7،8. بالإضافة إلى ذلك ، Cx. pipiens molestus تميل إلى أن تكون أكثر أنثروبوفيليا في حين Cx. pipiens و Cx. quinquefasciatus هي أكثرzoophilic 6. ومع ذلك ، في الولايات المتحدة وفي جميع أنحاء العديد من الأماكن الأخرى في العالم ، تهجين هذه الأنواع ، مما له آثار قوية على انتقال المرض كهجينات من Cx. pipiens pipiens و Cx. pipiens molestus هي مغذيات انتهازية وستعض كل من الطيور والبشر9، وبالتالي تعمل كناقلات جسر لفيروس غرب النيل. وقد تعرقلت دراسة هذه الجوانب وغيرها من الجوانب الرائعة لبيولوجيا البعوض Culex ، ويرجع ذلك جزئيا ، لأن البعوض Culex هي أكثر صعوبة قليلا لتربية في المختبر من البعوض الزاعجة ، والتي تنتج البيض هادئة ومقاومة للجفاف10 ولأن الأدوات الجزيئية الوظيفية ليست متطورة بشكل جيد لأنواع Culex.
CRISPR/Cas9 تحرير الجينوم هو التكنولوجيا القوية التي تم استخدامها لتقييم بيولوجيا العديد من أنواع البعوض الهامة11،12،13، بما في ذلك البعوض البيت الجنوبي ، Culex quinquefasciatus14،15،16. هذه التكنولوجيا، التي وضعتها جنيفر دودنا وإيمانويل شاربنتييه، يستغل الدفاع البكتيري الطبيعي ضد الفيروسات عن طريق المشتقة من البكتيريا، وEDONUCLEASES كريسبر المرتبطة (بروتينات كاس؛ انظر الاستعراض من قبل فان دير أوستوآخرون. 17). عند حقنها في الأجنة الحيوانية، يمكن للبروتينات Cas9 بالاشتراك مع الحمض النووي الريبي دليل مناسب تنتج فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل داخل الجينوم. ويتم ذلك في أغلب الأحيان باستخدام بروتين Cas9 المعقد مع الرناس الإرشادي ، الذي يوجه نشاط الإندونوكليا إلى منطقة محددة من الجينوم. بعد أن خلق البروتين Cas9 كسر مزدوجة تقطعت بهم السبل موقع محدد، والآلات الخلوية محاولات لإصلاح كسر باستخدام واحدة من آليتين. الأول ينطوي على ربط الطرفين معا من خلال الانضمام إلى نهاية غير متجانسة (NHEJ) ، وهو عرضة للخطأ وغالبا ما تنتج عمليات الإدراج والحذف خارج الإطار في الجينوم التي يمكن أن تؤدي إلى بروتينات غير وظيفية ، وبالتالي توليد طفرة خروج المغلوب. بدلا من ذلك، قد تستخدم الآلات الخلوية إصلاح موجهة بالأوهام (HDR) عن طريق العثور على تسلسل مماثل لإصلاح الفاصل بشكل صحيح. ويمكن توفير تسلسل مماثل من الكروموسوم الثاني داخل الكائن الحي (انظر الاستعراض18). ومع ذلك ، إذا كان التسلسل الذي تم إصلاحه يطابق التسلسل الأصلي تماما ، فسيتمكن بروتين Cas9 من قطع الحمض النووي مرة أخرى. وبدلا من ذلك، يمكن للباحثين أيضا تضمين بلازميد متبرع يحتوي على تسلسلات متجانسة على جانبي موقع القطع للتسلسل المستهدف مع تسلسل إصلاح بديل – غالبا ما يكون بروتين علامة فلورية، أو نسخة معدلة من الجين الأصلي، أو أي تعديل آخر – يمكن نسخه وإدخاله في الجينوم، أو “طرقه”.
التوقيت أمر بالغ الأهمية عند حقن الأجنة ، وهذا هو الحال بشكل خاص عند استخدام تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 لإنشاء طفرات في الحشرات. وذلك لأن بروتين Cas9 وgRNAs لديهما القدرة الأكبر على توليد الطفرات فقط عندما يكون الجنين في حالته المتزامنة ، قبل أن تتشكل الأغشية الخلوية وعندما يمكن الوصول إلى نواة متعددة داخل الجنين. للبعوض ، تصل النوى إلى المحيط بعد ~ 2-4 ساعات من التكاثر ، اعتمادا على درجة الحرارة19، وبالتالي يجب أن يحدث تحري دقيق ناجح قبل هذا الوقت. بالإضافة إلى ذلك، فإن البروتين Cas9 قطع أي الحمض النووي التي يمكن الوصول إليها، بحيث الفرد الناتج عن الحقن سوف تحتوي على فسيفساء من الخلايا، وبعضها لديه الطفرة المطلوبة، والبعض الآخر لا. من أجل أن تكون هذه الطفرات موروثة بنجاح، يجب على بروتين Cas9 قطع الحمض النووي الذي يوجد في الجرثومة التي من شأنها أن تؤدي إلى البويضات والحيوانات المنوية في المستقبل. لضمان أن يتم إنشاء الطفرات في الجرثومة فمن الأفضل لحقن جميع المواد القريبة من موقع خلايا القطب داخل الجنين ، والتي هي السلف من الجرثومة الحشرية. وتقع خلايا القطب بالقرب من النهاية الخلفية للأجنة Culex 20. بالإضافة إلى حقن الأجنة، من الضروري وضع خطة دقيقة لعبور وفحص النسل من أجل الكشف عن الطفرة المرجوة.
يصف هذا البروتوكول كيفية توليد gRNAs وتعقيدها مع بروتين Cas9 لإعداد خلطات الحقن ، وكذلك كيفية حث البعوض الأنثوي من Culex pipiens على وضع البيض وكيفية إعداد وحقن تلك البيض لتحرير الجينوم بوساطة CRISPR/Cas9. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بوصف كيفية تربية الأجنة المحقونة وذرية الصليب وفحصها لتأكيد أنه تم الحصول على الطفرة المطلوبة. باستخدام هذا البروتوكول، قمنا بتوليد الطفرات فارغة لجين من الاهتمام، دورة،في سلالة باكاي من Culex pipiens. تأسست هذه السلالة في الأصل في عام 2013 من البعوض الذي تم جمعه ميدانيا في كولومبوس، أوهايو، ويحتفظ بها مختبر ميوتي. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء دراسات إضافية تتطلب تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 في بعوض Culex ، وكذلك أنواع البعوض الأخرى ، وبشكل أعم ، وثيق الصلة بتوظيف تحرير الجينوم CRISPR /Cas9 لأي نوع من أنواع الحشرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم هذا البروتوكول طرقا لإدخال طفرات محددة في جينوم بعوض Culex ويمكن استخدامه لتحرير جينوم البعوض الآخر أيضا. البروتوكول مهم من حيث أنه يوفر تفاصيل محددة ليس فقط عن كيفية إعداد مواد الحقن ، ولكن أيضا لمحة عامة مفصلة عن كيفية حث البعوض على وضع البيض ، وكذلك كيفية إعداد وحقن تلك البيضات. ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ديفيد أوبروشتا وجميع أعضاء شبكة أبحاث تنسيق التقنيات الوراثية الحشرية على المساعدة والتدريب الذي يقدمونه لنا وللآخرين على تنفيذ التقنيات الوراثية. نشكر بشكل خاص تشانا الوفيهاري لتحسين بروتوكول الضخ الدقيق للسماح بحقن أجنة Culex وتفقيسها. كما نشكر ديفانتي سيمونز وجوزيف أورسو، الطلاب الجامعيين العاملين في مختبر ميوتي، على مساعدتهم في رعاية وفحص البعوض المعدل وراثيا، وزورا إلمكامي من ال ITF للمساعدة في تربية البعوض وإعداده للحقن. وقد دعم هذا العمل منحة متعددة التخصصات من معهد الأمراض المعدية في جامعة ولاية أوسو قدمت إلى وزارة الميكنة.
Materials
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
Riferimenti
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes. Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).
- Sabry, M. A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis. The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).
- Cancrini, G., et al. Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).
- Wilton, D. P., Smith, G. C. Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).
- Mattingly, P. F. The Culex pipiens complex. Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).
- Eldridge, B. F. The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).
- Spielman, A., Wong, J. Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens. Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).
- Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring. Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).
- Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).
- Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 10 (3), (2015).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Liu, T., et al. Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus. Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).
- Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies. Scientific Reports. 6, 24652 (2016).
- Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).
- Anderson, M. E., et al. CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say. PloS one. 14 (11), (2019).
- Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Monnerat, A. T., et al. Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).
- Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae). Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
