Embryo's van Culex-muggen voorbereiden en injecteren om null-mutaties te genereren met CRISPR/Cas9
Summary
CRISPR/Cas9 wordt steeds vaker gebruikt om genfunctie in niet-modelorganismen te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe knock-out lijnen van Culex pipienste genereren, van het bereiden van injectiemengsels tot het verkrijgen en injecteren van muggenembryo’s, evenals hoe geïnjecteerde muggen en hun nakomelingen op te wekken, te kruisen en te screenen op gewenste mutaties.
Abstract
Culexmuggen zijn de belangrijkste vectoren van verschillende ziekten die een negatieve invloed hebben op de gezondheid van mens en dier, waaronder het West-Nijlvirus en ziekten veroorzaakt door filariale nematoden zoals hondenhartworm en elephantasis. Onlangs is CRISPR/Cas9 genoombewerking gebruikt om site-gerichte mutaties te induceren door een Cas9-eiwit te injecteren dat is gecomplexeerd met een gids-RNA (gRNA) in vers gelegde embryo’s van verschillende insectensoorten, waaronder muggen die behoren tot de geslachten Anopheles en Aedes. Het manipuleren en injecteren van Culex-muggen is iets moeilijker omdat deze muggen hun eieren rechtop in vlotten leggen in plaats van individueel zoals andere soorten muggen. Hier beschrijven we hoe we gRNAs kunnen ontwerpen, complexen met Cas9-eiwit, vrouwelijke muggen van Culex pipiens stimuleren om eieren te leggen en hoe ze nieuw gelegde embryo’s kunnen bereiden en injecteren voor micro-injection met Cas9 / gRNA. We beschrijven ook hoe geïnjecteerde muggen kunnen worden achtergelaten en gescreend op de gewenste mutatie. De representatieve resultaten tonen aan dat deze techniek kan worden gebruikt om site-gerichte mutaties in het genoom van Culex-muggen te induceren en, met kleine aanpassingen, kan worden gebruikt om ook null-mutanten bij andere muggensoorten te genereren.
Introduction
Culexmuggen worden verspreid over de gematigde en tropische regio’s van de wereld en brengen verschillende dodelijke virussen over, waaronder West Nile virus1,St. Louis encefalitis2 en filariale nematoden die hondenhartworm3 en elephantiasis4veroorzaken. Leden van het Culex pipiens complex, waaronder Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens en Cx. pipiens molestus, vertonen opvallende variaties in vele aspecten van hun biologie. Bijvoorbeeld, terwijl Cx. quinquefasciatus en Cx. pipiens molestus niet in staat zijn om een overwinterende rust in te gaan5,6, vertonen Cx. pipiens pipiens robuuste seizoensreacties en gaan diapause in als reactie op korte dagen7,8. Bovendien zijn Cx. pipiens molestus meestal meer antropofiel, terwijl Cx. pipiens en Cx. quinquefasciatus meer zoöfiel zijn6. In de Verenigde Staten en op vele andere plaatsen in de wereld kruisten deze soorten echter, wat sterke implicaties heeft voor de overdracht van ziekten als hybriden van de Cx. pipiens pipiens en Cx. pipiens molestus zijn opportunistische feeders en zullen zowel vogels als mensen bijten9, waardoor ze dienen als brugvectoren voor het West Nile-virus. Het bestuderen van deze en andere fascinerende aspecten van de biologie van Culex-muggen is gehinderd, deels omdat Culex-muggen iets moeilijker op te eten zijn in het lab dan Aedes-muggen, die rustgevende en uitdrogingsbestendige eieren produceren10 en omdat functionele moleculaire gereedschappen niet zo goed zijn ontwikkeld voor Culex-soorten.
CRISPR/Cas9 genoombewerking is een krachtige technologie die is gebruikt om de biologie van verschillende belangrijke muggensoorten11 , 12,13te evalueren , waaronder de zuidelijke huismug, Culex quinquefasciatus14,15,16. Deze technologie, ontwikkeld door Jennifer Doudna en Emmanuelle Charpentier, maakt gebruik van een natuurlijke bacteriële afweer tegen virussen door bacterieel afgeleide, CRISPR-geassocieerde endonucleases (Cas-eiwitten; zie recensie door Van der Oost et al.17). Wanneer ze in dierlijke embryo’s worden geïnjecteerd, kunnen de Cas9-eiwitten in combinatie met een geschikte gids RNA dubbelstrengs breuken in het genoom veroorzaken. Dit wordt meestal gedaan door het Cas9-eiwit te gebruiken dat is gecomplexeerd met gids-RNA’s, dat endonuclease-activiteit naar een specifiek gebied van het genoom leidt. Nadat het Cas9-eiwit een site-specifieke dubbelstrengs breuk heeft gecreëerd, probeert de cellulaire machine de breuk te repareren met behulp van een van de twee mechanismen. De eerste houdt in dat de twee uiteinden samen worden samengevoegd door niet-homologe eindvoeging (NHEJ), die foutgevoelig is en vaak out-frame inserties en deleties in het genoom produceert die kunnen resulteren in niet-functionele eiwitten, waardoor een knock-outmutatie wordt gegenereerd. Als alternatief kunnen de cellulaire machines homologie-gerichte reparatie (HDR) gebruiken door vergelijkbare sequenties te vinden om de breuk correct te repareren. De vergelijkbare sequentie kan worden geleverd door het tweede chromosoom in het organisme (zie review18). Als de gerepareerde sequentie echter precies overeenkomt met de oorspronkelijke sequentie, kan het Cas9-eiwit het DNA opnieuw snijden. Als alternatief kunnen onderzoekers ook een donorplasmide opnemen die homologe sequenties aan weerszijden van de snijplaats van de doelsequentie bevat met een alternatieve reparatiesequentie – vaak een fluorescerend marker-eiwit, een gewijzigde versie van het oorspronkelijke gen of een andere wijziging – die kan worden gekopieerd en ingevoegd in het genoom, of “knock-in”.
Timing is van cruciaal belang bij het injecteren van embryo’s, en dit is vooral het geval bij het gebruik van CRISPR / Cas9 genoombewerking om mutaties in insecten te creëren. Dit komt omdat het Cas9-eiwit en de gRNAs de grootste capaciteit hebben om mutaties alleen te genereren wanneer het embryo zich in zijn syncytiële toestand bevindt, voordat cellulaire membranen zich hebben gevormd en wanneer meerdere kernen toegankelijk zijn in het embryo. Voor muggen bereiken kernen de periferie ~ 2-4 uur na ovipositie, afhankelijk van temperatuur19, en daarom moet succesvolle micro-injection vóór deze tijd plaatsvinden. Bovendien snijdt het Cas9-eiwit elk nucleair DNA waar het toegang toe heeft, zodat het individu dat uit de injectie voortvloeit een mozaïek van cellen zal bevatten, sommige met de gewenste mutatie en anderen niet. Om deze mutaties met succes te kunnen erven, moet het Cas9-eiwit DNA snijden dat zich in de kiembaan bevindt dat aanleiding zal geven tot de toekomstige eieren en sperma. Om ervoor te zorgen dat mutaties in de kiembaan worden gegenereerd, is het het beste om alle materialen dicht bij de locatie van de poolcellen in het embryo te injecteren, die de voorlopers van de insectenkiembaan zijn. De poolcellen bevinden zich in de buurt van het achterste uiteinde van Culex-embryo’s 20. Naast het injecteren van embryo’s is het noodzakelijk om een zorgvuldig plan te ontwikkelen voor het kruisen en screenen van nakomelingen om de gewenste mutatie te detecteren.
Dit protocol beschrijft hoe je gRNAs kunt genereren en complexen met Cas9-eiwitten om injectiemengsels te bereiden, evenals hoe vrouwelijke muggen van Culex-pipiens eieren kunnen leggen en hoe ze die eieren kunnen bereiden en injecteren voor CRISPR / Cas9-gemedieerde genoombewerking. Daarnaast beschrijven we hoe geïnjecteerde embryo’s en hun nakomelingen kunnen worden grootgebracht, gekruist en gescreend om te bevestigen dat de gewenste mutatie is verkregen. Met behulp van dit protocol genereerden we null-mutaties voor een gen van belang, cyclus, in de Buckeye-stam van Culex pipiens. Deze soort werd oorspronkelijk opgericht in 2013 van in het veld verzamelde muggen in Columbus, Ohio en wordt onderhouden door het Meuti-lab. Dit protocol kan worden gebruikt voor aanvullende studies die CRISPR / Cas9 genoombewerking vereisen bij Culex-muggen, evenals andere muggensoorten, en, meer in het algemeen, is relevant voor het gebruik van CRISPR / Cas9-genoombewerking voor elke insectensoort.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol presenteert methoden om specifieke mutaties in het genoom van Culex-muggen te introduceren en kan ook worden gebruikt om het genoom van andere muggen te bewerken. Het protocol is belangrijk omdat het specifieke details biedt over niet alleen hoe de injectiematerialen moeten worden bereid, maar ook een gedetailleerd video-overzicht van hoe muggen eieren kunnen leggen, evenals hoe die eieren te bereiden en te injecteren. We vatten ook samen hoe te profiteren van de biologie van vrouwelijke Cx. pip…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. David O’Brochta en alle leden van het Insect Genetic Technologies Coordination Research Network voor de hulp en training die zij ons en anderen bieden over de implementatie van genetische technologieën. We danken channa Aluvihare in het bijzonder voor het optimaliseren van het micromanipulatieprotocol om Culex-embryo’s te kunnen injecteren en uit te komen. We danken ook Devante Simmons en Joseph Urso, niet-gegradueerde studenten die in het Meuti-lab werken, voor hun hulp bij het verzorgen en screenen van transgene muggen, en Zora Elmkami van de ITF voor hulp bij het fokken en voorbereiden van muggen voor injectie. Dit werk werd ondersteund door een Interdisciplinary Seeds-subsidie van het Infectious Diseases Institute van osu die aan MEM werd verstrekt.
Materials
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
Riferimenti
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes. Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).
- Sabry, M. A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis. The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).
- Cancrini, G., et al. Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).
- Wilton, D. P., Smith, G. C. Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).
- Mattingly, P. F. The Culex pipiens complex. Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).
- Eldridge, B. F. The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).
- Spielman, A., Wong, J. Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens. Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).
- Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring. Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).
- Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).
- Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 10 (3), (2015).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Liu, T., et al. Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus. Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).
- Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies. Scientific Reports. 6, 24652 (2016).
- Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).
- Anderson, M. E., et al. CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say. PloS one. 14 (11), (2019).
- Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Monnerat, A. T., et al. Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).
- Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae). Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
