Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen
Summary
Wir stellen hier eine Methode vor, die die Verwendung von chemischer epigenetischer Auslöschung mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren effizient zu erzeugen, ohne dass Gentransfektion oder retrovirale Vektoren erforderlich sind. Diese Strategie ist daher vielversprechend für die translationale Medizin und stellt einen bemerkenswerten Fortschritt in der Stammzellorganoidtechnologie dar.
Abstract
Der Zellphänotyp kann mit verschiedenen Methoden umgekehrt oder modifiziert werden, mit Vorteilen und Einschränkungen, die für jede Technik spezifisch sind. Hier beschreiben wir eine neue Strategie, die die Verwendung von chemischer epigenetischer Auslöschung mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen. Zwei Hauptschritte sind erforderlich. Im ersten Schritt werden adulte reife (terminally differentiierte) Zellen dem epigenetischen Radiergummi 5-aza-cytidin ausgesetzt, um sie in einen pluripotenten Zustand zu treiben. Dieser Teil des Protokolls wurde entwickelt, basierend auf dem zunehmenden Verständnis der epigenetischen Mechanismen, die das Schicksal und die Differenzierung von Zellen steuern, und beinhaltet die Verwendung des epigenetischen Modifikators, um den Zelldifferenzierungszustand zu löschen und dann in ein vorübergehendes Fenster mit hoher Plastizität zu fahren.
Im zweiten Schritt werden gelöschte Zellen in Mikrobioreaktoren aus Polytetrafluorethylen (PTFE), auch bekannt als Liquid Marbles, eingekapselt, um die Umlagerung von 3D-Zellen zu fördern und die erworbene hohe Plastizität stabil zu halten. PTFE ist eine nicht-reaktive hydrophobe synthetische Verbindung und ihre Verwendung ermöglicht die Schaffung einer zellulären Mikroumgebung, die in herkömmlichen 2D-Kultursystemen nicht erreicht werden kann. Dieses System fördert und fördert die Aufrechterhaltung der Pluripotenz durch bio-mechanosensing-bezogene Hinweise.
Die hier beschriebenen technischen Verfahren sind einfache Strategien, um die Induktion und Aufrechterhaltung eines hohen Plastizitätszustands in adulten Körperzellen zu ermöglichen. Das Protokoll erlaubte die Ableitung von Zellen mit hoher Plastizität bei allen getesteten Säugetierarten. Da es nicht die Verwendung von Gentransfektion beinhaltet und frei von viralen Vektoren ist, kann es einen bemerkenswerten technologischen Fortschritt für translationale medizinische Anwendungen darstellen. Darüber hinaus bietet das Mikrobioreaktorsystem einen bemerkenswerten Fortschritt in der Stammzell-Organoid-Technologie, indem es in vitro eine spezifische Mikroumgebung schafft, die die langfristige Kultur von Zellen mit hoher Plastizität ermöglicht, nämlich als ES-, iPS-, epigenetisch gelöschte Zellen und MSCs.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten wurde das weithin akzeptierte Konzept der unidirektionalen Progression in Richtung Zellbindung und -differenzierung vollständig überarbeitet. Es wurde gezeigt, dass die Zellspezifikation umgekehrt werden kann und eine terminaldifferenzierte Zelle mit verschiedenen Methoden in einen weniger engagierten und höheren permissiven Zustand gedrängt werden kann.
Unter den verschiedenen vorgeschlagenen Methoden besteht eine der vielversprechendsten Methoden darin, chemische Verbindungen zu verwenden, um Zellen in eine sogenannte chemisch induzierte Pluripotenz zu induzieren. Die bei diesem Ansatz verwendeten kleinen Moleküle sind in der Lage, die epigenetische Signatur einer erwachsenen reifen Zelle zu interagieren und zu modifizieren, wodurch die Notwendigkeit eines transgenen und/oder viralen Vektorsvermieden wird 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Zahlreiche Studien haben kürzlich gezeigt, dass es möglich ist, Zellen von einem Phänotyp auf einen anderen umzuschalten, indem spezifische biochemische und biologische Reize bereitgestellt werden, die die Reaktivierung hypermethylierter Gene 11,12,13,14,15 induzieren. Diese Demethylierungsereignisse ermöglichen die Umwandlung von terminaldifferenzierten Zellen in einen primitiven Vorläufer, eine multipotente oder eine hochplastische/pluripotente Zelle 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Parallel dazu haben sich viele Studien in letzter Zeit auf das Verständnis von mechanosensing-bezogenen Hinweisen konzentriert und insbesondere auf die Möglichkeit, mechanische Kräfte zu nutzen, um die Zellplastizität und / oder Differenzierung direkt zu beeinflussen16,17,18,19. Tatsächlich wurde eindeutig nachgewiesen, dass die extrazelluläre Matrix (ECM) eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle des Zellschicksals spielt. Insbesondere die von ECM erzeugten biomechanischen und biophysikalischen Signale regulieren direkt molekulare Mechanismen und Signalwege und beeinflussen das Zellverhalten und die Zellfunktionen20,21. Diese jüngsten Daten haben den Weg für die Entwicklung neuartiger 3D-Kultursysteme geebnet, die die In-vivo-Zellmikroumgebung genauer nachahmen und mechanische und physikalische Reize replizieren, die das Zellverhalten antreiben.
Wir beschreiben hier ein zweistufiges Protokoll, das die Verwendung von chemischem epigenetischem Löschen mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen. Im ersten Schritt werden Zellen mit dem Demethylierungsmolekül 5-Aza-Cytidin (5-aza-CR) inkubiert. Dieser Wirkstoff ist in der Lage, eine signifikante globale DNA-Demethylierung durch eine kombinierte Wirkung der direkten Ten-Eleven-Translokation 2 (TET2)-vermittelten Wirkung 8,10 und der indirekten Hemmung der DNA-Methyltransferasen (DNMT)22,23 zu induzieren. Dieser Schritt induziert die Entfernung der epigenetischen Blockaden mit einer anschließenden Reaktivierung der pluripotenzbedingten Genexpression und damit die Erzeugung von Zellen mit hoher Plastizität 1,2,3,8,10, im Folgenden als “epigenetisch gelöschte Zellen” bezeichnet. Im zweiten Schritt werden die Zellen in einem 3D-Kultursystem verkapselt. Zu diesem Zweck wird die nicht-reaktive hydrophobe synthetische Verbindung Polytetrafluorethylen (PTFE; mit einer Partikelgröße von 1 μm) als Mikrobioreaktor verwendet, der die Schaffung einer zellulären Mikroumgebung ermöglicht, die durch den Einsatz herkömmlicher 2D-Kultursystemenicht erreichbar ist 10. Die PTFE-Pulverpartikel haften an der Oberfläche des Flüssigkeitstropfens, in dem die Zellen wieder suspendiert werden, und isolieren den Flüssigkeitskern von der Stützoberfläche, während sie einen Gasaustausch zwischen der inneren Flüssigkeit und der Umgebung ermöglichen24. Der so erhaltene “PTFE-Mikrobioreaktor”, auch bekannt als “Liquid Marble”, ermutigt die Zellen, frei miteinander zu interagieren, fördert die 3D-Zellumlagerung25,26,27 und verlängert und hält den erworbenen Zustand mit hoher Plastizität durch bio-mechanosensing-bezogene Hinweise10 stabil aufrecht.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den letzten Jahrzehnten konzentrierten sich mehrere Studien auf die Entwicklung von Strategien, um eine terminale differenzierte Zelle in einen weniger engagierten und höheren freizügigen Zustand zurückzuversetzen. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Erzeugung und langfristige Aufrechterhaltung pluripotenter Zellen, ausgehend von adulten reifen terminaldifferenzierten Zellen. Die Methode kombiniert zwei unabhängige Schritte, die die Induktion eines hohen permissiven Zustands beinhalten, der durch chemi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Carraresi Foundation und MiND FoodS Hub ID: 1176436 finanziert. Alle Autoren sind Mitglieder der COST Action CA16119 In vitro 3-D Total Cell Guidance and Fitness (CellFit).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Riferimenti
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2′-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
