En tvåstegsstrategi som kombinerar epigenetisk modifiering och biomekaniska ledtrådar för att generera däggdjurs pluripotenta celler
Summary
Vi presenterar här en metod som kombinerar användningen av kemisk epigenetisk radering med mekanosensingsrelaterade ledtrådar för att effektivt generera däggdjurs pluripotenta celler, utan behov av gentransfektion eller retrovirala vektorer. Denna strategi är därför lovande för translationell medicin och representerar ett anmärkningsvärt framsteg inom stamcellsorganoidteknologi.
Abstract
Cellfenotyp kan vändas eller modifieras med olika metoder, med fördelar och begränsningar som är specifika för varje teknik. Här beskriver vi en ny strategi som kombinerar användningen av kemisk epigenetisk radering med mekanosenseringsrelaterade ledtrådar för att generera däggdjurs pluripotenta celler. Två huvudsteg krävs. I det första steget utsätts vuxna mogna (terminalt differentierade) celler för det epigenetiska radergummit 5-aza-cytidin för att driva dem till ett pluripotent tillstånd. Denna del av protokollet utvecklades, baserat på den ökande förståelsen för de epigenetiska mekanismerna som styr cellens öde och differentiering, och involverar användning av den epigenetiska modifieraren för att radera celldifferentierat tillstånd och sedan köra in i ett övergående fönster med hög plasticitet.
I det andra steget är raderade celler inkapslade i polytetrafluoretylen (PTFE) mikrobioreaktorer, även kända som flytande marmor, för att främja 3D-cellomläggning för att förlänga och stabilt upprätthålla den förvärvade höga plasticiteten. PTFE är en icke-reaktiv hydrofob syntetisk förening och dess användning tillåter skapandet av en cellulär mikromiljö, vilket inte kan uppnås i traditionella 2D-odlingssystem. Detta system uppmuntrar och ökar upprätthållandet av pluripotens genom bio-mekanosensing-relaterade ledtrådar.
De tekniska procedurer som beskrivs här är enkla strategier för att möjliggöra induktion och underhåll av ett högt plasticitetstillstånd i vuxna somatiska celler. Protokollet tillät härledning av celler med hög plasticitet i alla testade däggdjursarter. Eftersom det inte involverar användning av gentransfektion och är fritt från virala vektorer, kan det representera ett anmärkningsvärt tekniskt framsteg för translationella medicinska applikationer. Dessutom ger mikrobioreaktorsystemet ett anmärkningsvärt framsteg inom stamcellsorganoidteknik genom att in vitro återskapa en specifik mikromiljö som möjliggör långsiktig odling av celler med hög plasticitet, nämligen som ESC, iPSCs, epigenetiskt raderade celler och MSC.
Introduction
Under de senaste decennierna har det allmänt accepterade begreppet enkelriktad progression mot cellengagemang och differentiering reviderats fullständigt. Det har visat sig att cellspecifikationen kan vändas, och en terminalt differentierad cell kan drivas mot ett mindre engagerat och högre tillåtet tillstånd med hjälp av olika metoder.
Bland de flera föreslagna metoderna innebär en av de mest lovande metoderna användning av kemiska föreningar för att inducera celler till en så kallad kemiskt inducerad pluripotens. De små molekylerna som används i detta tillvägagångssätt kan interagera och modifiera den epigenetiska signaturen hos en vuxen mogen cell, vilket undviker behovet av någon transgen och / eller viral vektor 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Många studier har nyligen visat att det är möjligt att byta celler från en fenotyp till en annan genom att tillhandahålla specifika biokemiska och biologiska stimuli som inducerar reaktivering av hypermetylerade gener 11,12,13,14,15. Dessa demetyleringshändelser möjliggör omvandling av terminalt differentierade celler till en primitiv stamfader, en multipotent eller en hög plasticitet / pluripotent cell 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Parallellt har många studier nyligen fokuserat på förståelsen av mekanosenseringsrelaterade ledtrådar och mer specifikt på möjligheten att använda mekaniska krafter för att direkt påverka cellens plasticitet och / eller differentiering 16,17,18,19. Det har faktiskt tydligt visats att den extracellulära matrisen (ECM) spelar en nyckelroll i kontrollen av cellöden. I synnerhet reglerar de biomekaniska och biofysiska signalerna som produceras av ECM direkt molekylära mekanismer och signalvägar, vilket påverkar cellbeteende och funktioner 20,21. Dessa senaste data har banat väg för utvecklingen av nya 3D-odlingssystem som närmare efterliknar in vivo-cellmikromiljön och replikerar mekaniska och fysiska stimuli som driver cellbeteende.
Vi beskriver här ett tvåstegsprotokoll som kombinerar användningen av kemisk epigenetisk radering med mekanosenseringsrelaterade ledtrådar för att generera däggdjurs pluripotenta celler. I det första steget inkuberas celler med den demetylerande molekylen 5-aza-cytidin (5-aza-CR). Detta medel kan inducera en signifikant global DNA-demetylering genom en kombinerad effekt av den direkta tio-elva translokation 2 (TET2)-medierade verkan 8,10 och den indirekta hämningen av DNA-metyltransferaserna (DNMT)22,23. Detta steg inducerar avlägsnandet av de epigenetiska blocken med en efterföljande återaktivering av pluripotensrelaterat genuttryck och därmed genereringen av celler med hög plasticitet 1,2,3,8,10, nedan kallade “epigenetiskt raderade celler”. I det andra steget kapslas celler in i ett 3D-odlingssystem. För detta ändamål används den icke-reaktiva hydrofoba syntetiska föreningen polytetrafluoretylen (PTFE; med partikelstorlek på 1 μm) som mikrobioreaktor, vilket möjliggör skapandet av en cellulär mikromiljö som inte kan uppnås genom användning av traditionella 2D-odlingssystem10. PTFE-pulverpartiklarna fäster vid ytan av vätskedroppen i vilken celler suspenderas igen och isolerar vätskekärnan från stödytan, samtidigt som gasutbyte mellan den inre vätskan och den omgivande miljöntillåts 24. Den sålunda erhållna “PTFE-mikrobioreaktorn”, även känd som “Flytande marmor”, uppmuntrar celler att fritt interagera med varandra, vilket främjar 3D-cellomläggning 25,26,27 och förlänger och stabilt upprätthåller det förvärvade tillståndet med hög plasticitet genom biomekanosenseringsrelaterade ledtrådar10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under de senaste decennierna fokuserade flera studier på utvecklingen av strategier för att återställa en terminalt differentierad cell mot ett mindre engagerat och högre tillåtet tillstånd. Protokollet som beskrivs här tillåter generering och långsiktigt underhåll av pluripotenta celler med början från vuxna mogna terminalt differentierade celler. Metoden kombinerar två oberoende steg som involverar induktion av ett högt tillåtande tillstånd som uppnås genom kemisk epigenetisk radering och dess efterf?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Carraresi Foundation och MiND FoodS Hub ID: 1176436. Alla författare är medlemmar i COST Action CA16119 In vitro 3-D total cellvägledning och kondition (CellFit).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Riferimenti
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2′-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
