Qui presentiamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule germinali meiotiche e post-meiotiche vive dai teste di topo adulti. Utilizzando un colorante legante il DNA a bassa citotossicità, eccitato dalla violetta e uno smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, si possono isolare popolazioni di cellule spermatogeniche altamente arricchite per molte applicazioni a valle.
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Articolo metodologico
Isolamento delle cellule spermatogeniche murine utilizzando un colorante legante del DNA permeabile alle cellule violetto
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'isolamento degli spermatociti meiotici è essenziale per studiare i meccanismi molecolari alla base della meiosi e della spermatogenesi. Sebbene esistano protocolli di isolamento cellulare stabiliti che utilizzano la colorazione Hoechst 33342 in combinazione con lo smistamento delle celle attivato dalla fluorescenza, richiede smistatori di celle dotati di un laser ultravioletto. Qui descriviamo un protocollo di isolamento cellulare usando la macchia DyeCycle Violet (DCV), un colorante legante del DNA a bassa citotossicità strutturalmente simile a Hoechst 33342. Il DCV può essere eccitato sia dai laser ultravioletti che da quelli viola, il che migliora la flessibilità di scelta dell'apparecchiatura, incluso uno smistatore di celle non dotato di un laser ultravioletto. Usando questo protocollo, si possono isolare tre sottopopolazioni a cellule vive in prophase I meiotico, tra cui leptotene/zigotene, pachytene e spermatociti diplotene, così come spermatidi rotondi post-meiotici. Descriviamo anche un protocollo per preparare la sospensione a cella singola dai test del mouse. Nel complesso, la procedura richiede un breve periodo di tempo per il completamento (4-5 ore a seconda del numero di celle necessarie), il che facilita molte applicazioni downstream.
Introduzione
La spermatogenesi è un processo complesso in cui una piccola popolazione di cellule staminali spermatogoniche sostiene la produzione continua di un gran numero di spermatozoi per tutta lavita adulta 1,2. Durante la spermatogenesi, il rimodellamento dinamico della cromatina avviene quando le cellule spermatogeniche subiscono meiosi per produrre spermatidi aploidi3,4,5. L'isolamento degli spermatociti meiotici è essenziale per l'indagine molecolare e sono stati stabiliti diversi approcci per isolare gli spermatociti mei....
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Protocollo
Questo protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (protocollo n. IACUC2018-0040) presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Installazione di attrezzature e reagenti per la preparazione della sospensione cellulare testicolare
- Preparare ogni stock enzimatico in 1x Hanks's Balanced Salt Solution (HBSS) e conservare a -20 °C. (Tabella1).
NOTA: Preparare in qualsiasi momento prima dell'esperimento. - Un giorno prima dell'esperimento: tubi di raccolta del mantello (tubi da 1,5 ml) con siero bovino fetale (FBS) a 4 °C durante la notte.
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Risultati
Un risultato rappresentativo di questo protocollo di ordinamento è illustrato nella figura 3. Il tempo totale di smistamento di due tester (un mouse) è di solito di circa 3 ore, che dipende dalla concentrazione della sospensione cellulare e dalla velocità di smistamento. Dopo lo smistamento, la purezza degli spermatociti è confermata dall'immunostaining di SYCP3 e γH2AX (Figura 3A). La purezza rappresentativa delle frazioni di spermatociti L/Z, P, D ordinate è r.......
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Discussione
Qui presentiamo un protocollo pratico e semplice per isolare le sottopopolazioni di spermatociti e spermatidi da un singolo topo maschio adulto. Per garantire la riproducibilità di questo protocollo, ci sono alcuni passaggi critici che necessitano di attenzione. Prima della digestione enzimatica, il passaggio di lavaggio mira a rimuovere le cellule interstiziali; dopo la digestione, questo passaggio aiuta a rimuovere spermatozoi e detriti. Lavare / centrifugare 3 volte è importante. Nella nostra ricetta del tampone di di.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri dei laboratori Namekawa, Yoshida e Maezawa per il loro aiuto; Katie Gerhardt per aver modificato il manoscritto; Mary Ann Handel per aver condiviso l'anticorpo H1T, il Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core per la condivisione delle apparecchiature FACS supportate da NIH S10OD023410; Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) a T.N.; Lalor Foundation Postdoctoral Fellowship ad A.S.; da AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) a S.Y.; il Research Project Grant della Divisione Servizi di Ricerca dell'Università di Azabu, Programma sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, de....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta da 1,5 ml | Watson | 131-7155C | |
| Piastra di Petri da 100 mm | Corning, Falcon | 351029 | |
| Provetta da centrifuga da 15 mL | Watson | 1332-015S | |
| Provetta in polistirene da 5 ml con tappo a scatto per filtro cellulare (35 &; m rete di nylon) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Provetta da centrifuga | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Piastra di Petri | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 &; m rete di nylon | Corning, Falcon | 352350 | |
| Selezionatrice cellulare | Sony | SH800S | |
| Centrifuga | |||
| Collagenasi, ricombinante, senza origine animale | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenasi, Tipo 1 | Worthington | LS004196 | |
| Vetro di copertura | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Feniliddolo, Dicloridrato) | Fisher | D1306 | concentrazione di lavoro: 0,1 μ g/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Siero d'asino | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t anticorpo | regalo da Mary Ann Handel | 1/2000 diluito | |
| Hank' Soluzione salina bilanciata (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Ialuronidasi da testicoli bovini | Sigma | H3506-1G | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX anticorpo | Millipore | 05-635 | Concentrazione di lavoro: 2 μ g/mL |
| di proteina di fecondazione spermatica 56 (Sp56) anticorpo | QED Bioscience | 55101 | concentrazione di lavoro: 0,5 μ g/mL |
| Pinze e forbici | |||
| Superfrost /Plus Vetrini per microscopio | Fisher | 12-550-15 | |
| Anticorpo SYCP3 | Abcam | ab205846 | concentrazione di lavoro: 5 μ g/mL |
| TWEEN 20 (Polisorbato 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Bagnomaria |
Riferimenti
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives ....
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Ristampe e permessi
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