Coltura tissutale della corteccia ovarica bovina

Summary

Viene presentata la coltura in vitro della corteccia ovarica bovina e l’effetto della dieta nutrizionale a gradini sul microambiente ovarico. I pezzi di corteccia ovarica sono stati coltivati per sette giorni e sono stati valutati steroidi, citochine e stadi follicolari. Il trattamento dietetico Stair-Step aveva aumentato la steroidogenesi con conseguente progressione del follicolo in coltura.

Abstract

Lo sviluppo del follicolo dallo stadio primordiale a quello antrale è un processo dinamico all’interno della corteccia ovarica, che include fattori endocrini e paracrini da cellule somatiche e comunicazione cellula-ovocita cumulo. Poco si sa sul microambiente ovarico e su come le citochine e gli steroidi prodotti nell’ambiente circostante influenzino la progressione o l’arresto del follicolo. La coltura in vitro della corteccia ovarica consente ai follicoli di svilupparsi in un ambiente normalizzato che rimane supportato da stroma adiacente. Il nostro obiettivo era determinare l’effetto della dieta nutrizionale Stair-Step sul microambiente ovarico (sviluppo follicolare, produzione di steroidi e citochine) attraverso la coltura in vitro della corteccia ovarica bovina. Per raggiungere questo obiettivo, i pezzi corticali ovarici sono stati rimossi dalle giovenche sottoposte a due diversi schemi nutrizionalmente sviluppati prima della pubertà: Control (sviluppo nutrizionale tradizionale) e Stair-Step (alimentazione e restrizione durante lo sviluppo) che sono stati tagliati in circa 0,5-1 mm³ pezzi. Questi pezzi sono stati successivamente passati attraverso una serie di lavaggi e posizionati su un inserto di coltura tissutale che è incastonato in un pozzo contenente il terreno di coltura di Waymouth. La corteccia ovarica è stata coltivata per 7 giorni con cambiamenti quotidiani dei terreni di coltura. Il sezionamento istologico è stato eseguito per determinare i cambiamenti dello stadio follicolare prima e dopo la coltura per determinare gli effetti della nutrizione e l’impatto della coltura senza ulteriori trattamenti. Il terreno di coltura della corteccia è stato raggruppato per giorni per misurare steroidi, metaboliti steroidei e citochine. C’erano tendenze per l’aumento degli ormoni steroidei nel microambiente ovarico che ha permesso la progressione del follicolo nelle colture di corteccia ovarica Stair-Step versus Control. La tecnica di coltura della corteccia ovarica consente una migliore comprensione del microambiente ovarico e di come le alterazioni della secrezione endocrina possono influenzare la progressione e la crescita del follicolo da trattamenti sia in vivo che in vitro. Questo metodo di coltura può anche rivelarsi utile per testare potenziali terapie che possono migliorare la progressione del follicolo nelle donne per promuovere la fertilità.

Introduction

La corteccia ovarica rappresenta lo strato esterno dell’ovaio in cui si verifica lo sviluppo del follicolo¹. I follicoli primordiali, inizialmente arrestati nello sviluppo, saranno attivati per diventare follicoli primari, secondari e quindi antrali o terziari basati su input paracrini e gonadotropine^1,2,3,4. Per comprendere meglio i processi fisiologici all’interno dell’ovaio, la coltura tissutale può essere utilizzata come modello in vitro, consentendo così un ambiente controllato per condurre esperimenti. Molti studi hanno utilizzato la coltura del tessuto ovarico per la ricerca nella tecnologia di riproduzione assistita, nella conservazione della fertilità e nel cancro ovarico^5,6,7. La coltura del tessuto ovarico è servita anche come modello per studiare le tossine riproduttive che danneggiano la salute ovarica e l’eziologia di disturbi riproduttivi come la sindrome dell’ovaio policistico (PCOS)^8,9,10,11. Pertanto, questo sistema di cultura è applicabile a una vasta gamma di specialità.

Nei roditori, gonadi fetali o perinatali intere sono state utilizzate negli esperimenti di biologia riproduttiva^12,13,14,15. Tuttavia, le gonadi di bestiame domestico più grande non possono essere coltivate come organi interi a causa delle loro grandi dimensioni e della potenziale degenerazione. Pertanto, la corteccia ovarica dei primati bovini e non umani viene tagliata in pezzi più piccoli^16,17,18. Molti studi hanno coltivato piccoli pezzi di corteccia ovarica per studiare vari fattori di crescita nell’iniziazione del follicolo primordiale nel bestiame domestico e nei primati non umani^1,17,18,19. L’uso della coltura della corteccia ovarica ha anche dimostrato l’inizio del follicolo primordiale in assenza di siero per pezzi corticali bovini e primati coltivati per 7 giorni²⁰. Yang e Fortune nel 2006 hanno trattato il terreno di coltura della corteccia ovarica fetale con una gamma di dosi di testosterone nell’arco di 10 giorni e hanno osservato che la concentrazione di^10-7 M di testosterone aumentava il reclutamento del follicolo, la sopravvivenza e l’aumento della progressione dei follicoli in fase iniziale¹⁹. Nel 2007, utilizzando colture di corteccia ovarica da feti bovini (5-8 mesi di gestazione), Yang e Fortune hanno riportato un ruolo per il fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGFA) nella transizione del follicolo primario-secondario²¹. Inoltre, il nostro laboratorio ha utilizzato colture di corteccia ovarica per dimostrare come le isoforme VEGFA (angiogeniche, antiangiogeniche e una combinazione) possono regolare diverse vie di trasduzione del segnale attraverso il recettore del dominio chinasico (KDR), che è il principale recettore di trasduzione del segnale che VEGFA lega¹⁶. Queste informazioni hanno permesso una migliore comprensione di come le diverse isoforme di VEGFA influenzano le vie di segnalazione per provocare la progressione o l’arresto del follicolo. Nel loro insieme, la coltura di pezzi di corteccia ovarica in vitro con diversi steroidi o fattori di crescita può essere un saggio prezioso per determinare gli effetti sui meccanismi che regolano la follicologenesi. Allo stesso modo, gli animali che si sviluppano su diversi regimi nutrizionali possono avere microambienti ovarici alterati, che possono promuovere o inibire la follicologenesi che influenza la maturità riproduttiva femminile. Pertanto, il nostro obiettivo nel manoscritto attuale è quello di riportare la tecnica di coltura della corteccia bovina e determinare se ci sono differenze nei microambienti ovarici dopo la coltura in vitro della corteccia bovina da giovenche alimentate con diete di controllo o Stair-Step raccolte a 13 mesi di età come descritto in precedenza¹⁶.

Pertanto, il nostro passo successivo è stato quello di determinare il microambiente ovarico in queste giovenche che sono state sviluppate con diverse diete nutrizionali. Abbiamo valutato la corteccia ovarica da giovenche alimentate con una dieta Stair-Step o Control. Alle giovenche di controllo è stata offerta una dieta di mantenimento di 97,9 g / kg^0,75 per 84 giorni. La dieta Stair-Step è stata iniziata a 8 mesi contenente una dieta ristretta di 67,4 g / kg^0,75 per 84 giorni. Dopo i primi 84 giorni, mentre le giovenche di controllo hanno continuato a ricevere 97,9 g/kg^0,75,alle giovenche di manzo Stair-Step sono stati offerti 118,9 g/kg^0,75 per altri 68 giorni, dopo di che sono state ovariectomizzate a 13 mesi di età¹⁶ anni per studiare i cambiamenti negli stadi follicolari e nella morfologia prima e dopo la coltura. Abbiamo anche analizzato le differenze in steroidi, metaboliti steroidei, chemochine e citochine secrete nei mezzi della corteccia. Gli steroidi e altri metaboliti sono stati misurati per determinare se ci fossero effetti diretti dai trattamenti condotti in vivo e/o in vitro sulla vitalità e la produttività dei tessuti. I cambiamenti nel microambiente ovarico prima e dopo la coltura hanno fornito un’istantanea dell’ambiente endocrino e della follicologenesi prima della coltura e di come la coltura o il trattamento durante la coltura influisce sulla progressione o sull’arresto del follicolo.

Le ovaie sono state raccolte dopo che le ovariectomie sono state eseguite presso il Meat Animal Research Center (USMARC) degli Stati Uniti secondo le loro procedure IACUC dalle giovenche control e stair-step a 13 mesi di età¹⁶anni, pulite con lavaggi sterili di soluzione salina tampone fosfato (PBS) con antibiotico allo 0,1% per rimuovere sangue e altri contaminanti, tagliato il tessuto in eccesso e trasportato al laboratorio di fisiologia riproduttiva UNL dell’Università del Nebraska-Lincoln (UNL) a 37 ° C²³ . All’UNL, i pezzi della corteccia ovarica sono stati tagliati in piccoli pezzi quadrati (~ 0,5-1 mm^3; Figura 1) e coltivato per 7 giorni (Figura 2). L’istologia è stata condotta sui vetrini di coltura della corteccia prima e dopo la coltura per determinare gli stadi follicoli^16,24 (Figura 3 e Figura 4)e le proteine della matrice extracellulare che possono indicare la fibrosi (Picro-Sirus Red, PSR; Figura 5). Ciò ha permesso la determinazione dell’effetto dei regimi nutrizionali in vivo sugli stadi follicolari e ha permesso il confronto di 7 giorni di corteccia ovarica sugli stadi follicolari e sulla progressione del follicolo. Durante tutta la coltura, il mezzo è stato raccolto e cambiato ogni giorno (circa il 70% dei media è stato raccolto ogni giorno; 250 μL / bene) in modo che gli ormoni giornalieri / citochine / chemochine possano essere valutati o raggruppati su giorni per ottenere concentrazioni medie. Gli steroidi come l’androstenedione (A4) e l’estrogeno (E2) possono essere raggruppati nell’arco di 3 giorni e valutati attraverso il test radioimmunologico (RIA; Figura 6) e raggruppati nell’arco di 4 giorni per animale e analizzati tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni-spettrometria di massa (HPLC-MS)^24,25 (Tabella 1). Gli array di citochine sono stati utilizzati per valutare le concentrazioni di citochine e chemochine nel terreno di coltura della corteccia ovarica²⁶ (Tabella 2). Le piastre di analisi della reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) sono state condotte per determinare l’espressione genica per specifiche vie di trasduzione del segnale, come dimostrato in precedenza¹⁶. Tutti gli steroidi, le citochine, lo stadio follicolare e i marcatori istologici forniscono un’istantanea del microambiente ovarico e indizi sulla capacità di quel microambiente di promuovere la follicologenesi “normale” o “anormale”.

Protocol

Le ovaie sono state ottenute dal Centro di ricerca sugli animali da carne degli Stati Uniti16. Come affermato in precedenza16,tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura e l’uso degli animali del Centro di ricerca sugli animali da carne degli Stati Uniti (USMARC) in conformità con la guida per la cura e l’uso degli animali agricoli nella ricerca e nell’insegnamento agricolo. Le ovaie sono state portate al laboratorio riproduttivo dell’Università del N…

Representative Results

Questa procedura di coltura della corteccia bovina può essere utilizzata per determinare un’ampia varietà di dati ormonali, citochine e istologici da piccoli pezzi dell’ovaio. La colorazione, come l’ematossilina e l’eosina (H & E), può essere utilizzata per determinare la morfologia ovarica attraverso la stadiazione del follicolo16,23,31 ( Figura3). In breve, i follicoli sono stati classificati c…

Discussion

Il vantaggio della coltura in vitro della corteccia ovarica, come descritto in questo manoscritto, è che i follicoli si sviluppano in un ambiente normalizzato con stroma adiacente che circonda i follicoli. Le cellule somatiche e gli ovociti rimangono intatti e vi è un’appropriata comunicazione cellula-cellula come modello in vivo. Il nostro laboratorio ha scoperto che un sistema di coltura a 7 giorni fornisce dati rappresentativi di follicologenesi e steroidogenesi per il trattamento della corteccia ovarica. Altri prot…

Materials

#11 Scapel Blade	Swann-Morton	303	Scaple Blade
#21 Scapel Blade	Swann-Morton	307	Scaple Blade
500mL Bottle Top Filter	Corning	430514	Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium
AbsoluteIDQ Sterol17 Assay	Biocrates	Sterol17 Kit	Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned
Androstenedione Double Antibody RIA Kit	MPBio	7109202	RIA to determine androstenedione from culture medium
Belgium A4 Assay Kit	DIA Source	KIP0451	RIA to determine androstenedione from culture medium
Bovine Cytokine Array Q3	RayBiotech	QAB-CYT-3-1	Cytokine kit to determine cytokines from culture medium
cellSens Software Standard 1.3	Olympus	7790	Imaging Software
Insulin-Transferrin-Selenium-X	Gibco ThermoFisher Scientific	5150056	Addative to the culture medium
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco ThermoFisher Scientific	4130039	Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet
Microscope	Olympus	SZX16	Disection microscope used for imaging tissue culture pieces
Microscope Camera	Olympus	DP71	Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter	Millipore Sigma	PICM01250	Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it
Multiwell 24 well plate	Falcon	353047	Plate used to hold meduim, inserts, and tissues
Petri dish 60 x 15 mm	Falcon	351007	Petri dish used for washing steps prior to culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X)	Corning	21-040-CV	Used for tissue washing
SAS Version 9.3	SAS Institute	9.3 TS1M2	Statistical analysis software
Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer	Thomas Scientific	6727C10	Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue
Waymouth MB 752/1 Medium	Sigma-Aldrich	W1625	Medium used for tissue cultures