Представленный способ включает одноосное растяжение 3D мягких гидрогелей, встроенных в силиконовую резину, при этом позволяя проводить живую конфокальную микроскопию. Показано определение характеристик внешних и внутренних деформаций гидрогеля, а также выравнивание волокон. Разработанное устройство и протокол могут оценивать реакцию клеток на различные режимы деформации.
Внешние силы являются важным фактором в формировании, развитии и поддержании тканей. Воздействие этих сил часто изучается с использованием специализированных методов растяжения in vitro. Различные доступные системы используют носилки на основе 2D-подложки, в то время как доступность 3D-методов для деформации мягких гидрогелей более ограничена. Здесь мы описываем метод, который позволяет внешне растягивать мягкие гидрогели от их окружности, используя упругую силиконовую полосу в качестве носителя образца. Система растяжения, используемая в этом протоколе, построена из 3D-печатных деталей и недорогой электроники, что делает ее простой и легкой для воспроизведения в других лабораториях. Экспериментальный процесс начинается с полимеризации толстых (>100 мкм) мягких гидрогелей фибрина (модуль упругости ~100 Па) в вырезе в центре силиконовой полосы. Силикон-гелевые конструкции затем прикрепляются к печатно-растягивающей устройству и помещаются на ступень конфокального микроскопа. При живой микроскопии активируется растягивающее устройство, и гели визуаизируются с различной величиной растяжения. Затем обработка изображений используется для количественной оценки результирующих деформаций геля, демонстрируя относительно однородные деформации и выравнивание волокон по всей толщине геля 3D (осьZ). Преимущества этого метода включают в себя возможность деформации чрезвычайно мягких гидрогелей в 3D при выполнении микроскопии in situ и свободу манипулировать геометрией и размером образца в соответствии с потребностями пользователя. Кроме того, при правильной адаптации этот метод может быть использован для растяжения других типов гидрогелей (например, коллагена, полиакриламида или полиэтиленгликоля) и может позволить анализировать реакцию клеток и тканей на внешние силы в более биомиметических 3D-условиях.
Реакция тканей на механические силы является неотъемлемой частью широкого спектра биологических функций, включая экспрессию генов1,дифференцировку клеток2и ремоделированиетканей 3. Кроме того, вызванные силой изменения во внеклеточном матриксе (ECM), такие как выравнивание и уплотнение волокон, могут влиять на поведение клеток и формирование тканей4,5,6. Структура волокнистой сетки ECM обладает интригующими механическими свойствами, такими как нелинейная упругость, неаффинная деформация и пластические деформации7,8,9,10,11,12. Эти свойства влияют на то, как клетки и окружающая их микросреда реагируют на внешние механические силы13,14. Понимание того, как ECM и ткани реагируют на механические силы, позволит прогрессировать в области тканевой инженерии и в разработке более точных вычислительных и теоретических моделей.
Наиболее распространенные методы механического растяжения образцов были сосредоточены на 2D-субстратах, нагруженных клетками, чтобы изучить влияние на поведение клеток. К ним относятся, например, нанесение деформации на подложки из полидиметилсилоксана (PDMS) и анализ углов переориентации клеток по отношению к направлению растяжения15,16,17,18,19. Тем не менее, методы, исследующие реакцию 3D-гидрогелей, встроенных в клетки, на внешнее растяжение, ситуацию, которая более точно имитирует микроокружение тканей, более ограничены. Достижения в области методов 3D-растяжения имеют особое значение, потому что клетки ведут себя по-разному на 2D-подложках по сравнению с 3D-матрицами20. Это поведение включает клеточную перестройку, уровни экспрессии белка и модели миграции21,22,23.
Методы и устройства, позволяющие растягивать 3D-образец, включают как коммерчески доступные24,25,26,27,28, так и разработанные для лабораторных исследований29. В этих методах используются рассываемые силиконовые трубки30,многозаборные камеры31,зажимы26,32,биореакторы11,33,консольныекамеры 34,35,36и магниты37,38. Некоторые методы генерируют растяжение, которое локально деформирует 3D-гидрогели, например, путем вытягивания игл из двух отдельных точек вгеле 5,в то время как другие допускают деформацию всей массы геля16. Более того, большинство из этих систем сосредоточены на анализе поля деформации в плоскости X-Y, с ограниченной информацией о поле деформации в Z-направлении. Кроме того, только несколько из этих устройств способны к микроскопической визуализации in situ. Основной проблемой визуализации in situ с высоким увеличением (например, конфокального микроскопа) является ограниченное рабочее расстояние в несколько сотен микрон от объектива до образца. Устройства, которые действительно позволяют визуализировать в реальном времени во время растяжения, жертвуют однородностью деформации в оси Zили относительно сложны и трудно воспроизводятся в других лабораториях39,40.
Такой подход к растяжению 3D-гидрогелей позволяет проводить статическую или циклическую одноосную деформацию во время живой конфокальной микроскопии. Растягивающее устройство (называемое «Smart Cyclic Uniaxial Stretcher — SCyUS») построено с использованием 3D-печатных деталей и недорогого оборудования, что позволяет легко воспроизводить в других лабораториях. К устройству прилагается коммерчески доступная силиконовая резина с геометрическим вырезом в центре. Компоненты гидрогеля полимеризуются для заполнения выреза. Во время полимеризации биологические гидрогели, такие как фибрин или коллаген, естественным образом прилипают к внутренним стенкам выреза. Используя SCyUS, силиконовая полоса ненатягивается, передавая контролируемые деформации во встроенный 3D-гидрогель41.
Эта система позволяет обеспечить уникальное сочетание функций и преимуществ по сравнению с другими существующими методами. Во-первых, система позволяет одноосное растяжение толстых 3D-мягких гидрогелей (толщиной >100 мкм, жесткость <1 кПа) с их периферии с Z-однороднойдеформацией по всему гидрогелю. Эти гидрогели слишком мягкие, чтобы их можно было сжимать и растягивать обычными методами растяжения. Во-вторых, растягивающее устройство может быть легко воспроизведено в других лабораториях, поскольку 3D-печать легко доступна для исследователей, а электроника, используемая в дизайне, является недорогой. В-третьих, и, возможно, самая привлекательная особенность, геометрия и размер выреза в силиконовой полосе могут быть легко обработаны, что позволяет настраивать градиенты деформации и граничные условия, а также использовать различные объемы образцов, вплоть до нескольких микролитров.
Представленный протокол состоит из формования фибринового геля в диски диаметром ~2 мм в силиконовых резиновых полосах толщиной 0,5 мм, продолженных одноосным растяжением под живой конфокальной микроскопией. Далее подробно обсуждаются экспериментальные процедуры измерения и анализа деформаций, действующих на геометрический вырез, внутренние деформации, выработанные в гидрогеле, а также результирующее выравнивание волокон после различных манипуляций с растяжением. Наконец, обсуждается возможность встраивания клеток в гидрогель и воздействия на них контролируемого внешнего растяжения.
Способ и протокол, представленные здесь, в значительной степени основаны на нашем предыдущем исследовании Roitblat Riba et al.41 Мы включаем здесь полное автоматизированное проектирование (CAD), Python и коды микроконтроллеров устройства SCyUS.
К основным преимущества…
The authors have nothing to disclose.
Некоторые фигуры, включенные здесь, были адаптированы с разрешения Центра проверки авторских прав: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Процеживание 3D-гидрогелей с однородными деформациями оси Z при одновременном создании изображений в живой микроскопии, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20002 | |
Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate |
Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22×40 mm |
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
EVICEL Fibrin Sealant (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL |
Fibrinogen Buffer | N/A | Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2) | |
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide |
High-Temperature Silicone Rubber | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain |
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
MicroVL 21R Centrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Primovert Light Microscope | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systèmes | N/A | |
SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
Servomotor – TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | For 50 mL tubes |
Sterile 10 cm non-culture plates | Corning | 430167 | |
Thrombin buffer | N/A | Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0) | |
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
USB Cable (Type B Male to Type A Male) | N/A | N/A | |
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |