Konjunkturbestemt fællesskabsisolation og identifikation hos mus
Summary
Præsenteret her er en protokol for isolering og forstærkning af aerob og fakultativ anaerob mus conjunctival commensal bakterier ved hjælp af en unik øjenpind og kultur-baseret berigelse skridt med efterfølgende identifikation af mikrobiologiske baserede metoder og MALDI-TOF massespektrometri.
Abstract
Den okulære overflade blev engang betragtet som immun privilegeret og abiotisk, men for nylig ser det ud til, at der er en lille, men vedvarende commensal tilstedeværelse. Identifikation og overvågning af bakteriearter ved okulær slimhinde har været udfordrende på grund af deres lave forekomst og begrænsede tilgængelighed af passende metoder til commensal vækst og identifikation. Der er to standard tilgange: kultur baseret eller DNA sekventering metoder. Den første metode er problematisk på grund af de begrænsede genindvindbare bakterier, og den anden tilgang identificerer både levende og døde bakterier, der fører til en afvigende repræsentation af det okulære rum. Vi udviklede en robust og følsom metode til bakteriel isolation ved at bygge videre på standard mikrobiologiske dyrkningsteknikker. Dette er en vatpind-baseret teknik, ved hjælp af en “in-lab” lavet tynd vatpind, der er målrettet den nederste bindehinde, efterfulgt af en forstærkning skridt for aerob og fakultet anaerob slægter. Denne protokol har gjort det muligt for os at isolere og identificere konjunktivalarter som Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.osv. Tilgangen er egnet til at definere commensal mangfoldighed hos mus under forskellige sygdomsforhold.
Introduction
Formålet med denne protokol er at forbedre den specifikke isolering af levedygtige og sjældne aerobe og fakultative anaerob mikrober fra den okulære bindehinde for at karakterisere okulært mikrobiom. Omfattende undersøgelser har profileret commensal slimhinde samfund på hud, tarm, luftveje og kønsorganer og viser, at disse samfund påvirker udviklingen af immunsystemet ogrespons 1,2,3. Okulære commensal samfund har vist sig at ændre sig under visse sygdomme patologier, såsom Tør øjensygdom4, Sjögrens syndrom5 og diabetes6. Men evnen til at definere en typisk okulær overflade commensal samfund er hæmmet af deres relativt lave overflod i forhold til de andre slimhinde steder6,7,8. Dette giver anledning til en kontrovers om, hvorvidt der er en hjemmehørende okulær mikrobiom, og hvis det findes, om det adskiller sig fra huden mikrobiom og dermed dens lokale indvirkning på den medfødte immunsystemet udvikling og respons. Denne protokol kan hjælpe med at løse dette problem.
Generelt er metoder til at definere den okulære commensal niche baseret på sekventering og kulturbaserede teknikker4,7,9. 16 S rDNA sekventering og BRISK analyse7 viser en bredere mangfoldighed end kulturbaserede teknikker, men er ude af stand til at skelne mellem levende og døde mikrober. Da den okulære overflade er fjendtligt indstillet over for mange mikrober på grund af at rive filmens antimikrobielle egenskaber4 generere en lang række DNA-fragmenter, vil DNA-baserede tilgange opdage disse artefakter, som kan forvrænge dataene mod identifikation af døde bakterier som bosiddende commensals snarere end forurenende stoffer. Dette resulterer i afvigende commensal identifikation og karakterisering af okulære rum som værende højere i mikrobe overflod og mangfoldighed10. Dette gør det vanskeligt at definere det bosiddende okulære mikrobiom via DNA-baserede metoder. standardkulturbaserede teknikker er ikke i stand til at påvise commensals, fordi belastningen er for lav11. Vores metode forbedrer standardpraksis ved at bruge en tynd vatpind, der kan målrette konjunktivaen og dermed undgå forurening fra nabohud, samt konceptet om, at levedygtige organismer kan beriges af kort kultur i næringsrige tætte medier med det formål at genoplive levedygtige, men ikke-dyrkelige, samt berigelse for sjældne levedygtige mikrober.
Resultaterne, relativ overflod af okulære commensals per øjenpind, karakteriserer bindehinden hjemmehørende mikrobiom og er vigtige for komparative formål. Vores data viser, at der er forskel på hud og konjunktivalmikrobiota samt større diversitet med øget alder og en kønsspecifik forskel i overflod. Desuden har denne tilgang reproducerbart fundet commensale forskelle i knock-out mus12. Denne protokol kan anvendes til at beskrive det okulære mikrobiom, som kan variere på grund af caging praksis, geografi, eller sygdomstilstand, samt de lokale virkninger af commensal metabolitter og produkter på immunsystemet udvikling og respons.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund af den okulære overflades paucibakterielle tilstand har mange laboratorier haft svært ved at isolere okulære commensals7,20, hvilket resulterer i lavt antal prøver med vækst, lav overflod og lav mangfoldighed8. Denne metode forbedrer standardkulturpraksissenbetydeligt 4,21 ved at tillægge et berigelsestrin samt en nydesignet øjenpind og identifikation af MALDI-TOF …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering fra P30 DK034854 støttede VY, LB og undersøgelser i Massachusetts Host-Microbiome Center og finansiering fra NIH/NEI R01 EY022054 støttede MG.
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
Riferimenti
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. . Laboratory Experiments in Microbiology. , (2010).
- Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
- UK SMI. . Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus–a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
