Bindehautkommusale Isolierung und Identifizierung bei Mäusen
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Amplifikation aerober und fakultativer anaerober Maus-Bindehaut-Kommensalbakterien unter Verwendung eines einzigartigen Augenabstrichs und eines kulturbasierten Anreicherungsschritts mit anschließender Identifizierung durch mikrobiologische Methoden und MALDI-TOF-Massenspektrometrie vorgestellt.
Abstract
Die Augenoberfläche galt einst als immunprivilegiert und abiotisch, aber in letzter Zeit scheint es, dass es eine kleine, aber anhaltende kommensale Präsenz gibt. Die Identifizierung und Überwachung von Bakterienarten an der Augenschleimhaut war aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und der begrenzten Verfügbarkeit geeigneter Methoden für das kommensale Wachstum und die Identifizierung eine Herausforderung. Es gibt zwei Standardansätze: kulturbasierte oder DNA-Sequenzierungsmethoden. Die erste Methode ist aufgrund der begrenzten rückgewinnbaren Bakterien problematisch und der zweite Ansatz identifiziert sowohl lebende als auch tote Bakterien, was zu einer abweichenden Darstellung des Augenraums führt. Wir haben eine robuste und empfindliche Methode zur Bakterienisolierung entwickelt, indem wir auf mikrobiologischen Standardkulturtechniken aufbauen. Dies ist eine auf Tupfern basierende Technik, bei der ein “im Labor” hergestellter dünner Tupfer verwendet wird, der auf die untere Bindehaut abzielt, gefolgt von einem Amplifikationsschritt für aerobe und fakultative anaerobe Gattungen. Dieses Protokoll hat es uns ermöglicht, Bindehautarten wie Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. usw.zu isolieren und zu identifizieren. Der Ansatz eignet sich, um die kommmensale Diversität bei Mäusen unter verschiedenen Krankheitsbedingungen zu definieren.
Introduction
Ziel dieses Protokolls ist es, die spezifische Isolierung lebensfähiger und seltener aerober und fakultativer anaerober Mikroben aus der okulären Bindehaut zu verbessern, um das okuläre Mikrobiom zu charakterisieren. Umfangreiche Studien haben kommensale Schleimhautgemeinschaften auf Haut, Darm, Atemwegen und Genitaltrakt profiliert und zeigen, dass diese Gemeinschaften die Entwicklung des Immunsystems und die Reaktion beeinflussen1,2,3. Es wurde gezeigt, dass sich okuläre Kommensalgemeinschaften während bestimmter Krankheitspathologien wie der Erkrankung des trockenen Auges4, des Sjögren-Syndroms5 und des Diabetes6verändern. Die Fähigkeit, eine typische kommensale Gemeinschaft an der Augenoberfläche zu definieren, wird jedoch durch ihre relativ geringe Häufigkeit im Vergleich zu den anderenSchleimhautstellen behindert 6,7,8. Dies löst eine Kontroverse darüber aus, ob es ein residentes Augenmikrobiom gibt und ob es existiert, ob es sich vom Hautmikrobiom und folglich seiner lokalen Wirkung auf die Entwicklung und Reaktion des angeborenen Immunsystems unterscheidet. Dieses Protokoll kann helfen, diese Frage zu lösen.
Im Allgemeinen basieren Ansätze zur Definition der okulären kommensalen Nische auf Sequenzierung und kulturbasierten Techniken4,7,9. 16 S rDNA-Sequenzierung und BRISK-Analyse7 zeigen eine größere Vielfalt als kulturbasierte Techniken, sind aber nicht in der Lage, zwischen lebenden und toten Mikroben zu unterscheiden. Da die Augenoberfläche für viele Mikroben aufgrund der antimikrobiellen Eigenschaften des Tränenfilms 4 feindlichist, die eine große Anzahl von DNA-Fragmenten erzeugen, werden DNA-basierte Ansätze diese Artefakte erkennen, die die Daten zur Identifizierung toter Bakterien als ansässige Kommensale und nicht als Verunreinigungen verzerren können. Dies führt zu einer abweichenden kommensalen Identifizierung und Charakterisierung des Augenraums als höher in Mikrobenhäufigkeit und Diversität10. Dies macht es schwierig, das ansässige okuläre Mikrobiom mit DNA-basierten Methoden zu definieren. Während Standardkulturbasierte Techniken keine Kommensalen erkennen können, weil die Last zu niedrig ist11. Unsere Methode verbessert die Standardpraktiken, indem sie einen dünnen Tupfer verwendet, der auf die Bindehaut abzielen kann, wodurch eine Kontamination durch benachbarte Haut vermieden wird, sowie das Konzept, dass lebensfähige Organismen durch kurze Kultur in nährstoffreichen Medien angereichert werden können, mit dem Ziel, lebensfähige, aber nicht kultivierbare, sowie die Anreicherung seltener lebensfähiger Mikroben wiederzubeleben.
Die Ergebnisse, relative Häufigkeit von okulären Kommensalen pro Augenabstrich, charakterisieren das Bindehaut-residente Mikrobiom und sind für Vergleichszwecke wichtig. Unsere Daten zeigen, dass es einen Unterschied zwischen Haut und Bindehautmikrobiota sowie eine größere Vielfalt mit zunehmendem Alter und einem geschlechtsspezifischen Unterschied in der Fülle gibt. Darüber hinaus hat dieser Ansatz reproduzierbar kommsale Unterschiede bei Knock-out-Mäusengefunden 12. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um das okuläre Mikrobiom zu beschreiben, das aufgrund von Käfigpraktiken, Geografie oder Krankheitszustand variieren kann, sowie die lokalen Auswirkungen von kommensalen Metaboliten und Produkten auf die Entwicklung und Reaktion des Immunsystems.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund des paucibakteriellen Zustands der Augenoberfläche hatten viele Labore Schwierigkeiten, die okulären Kommensalen7,20zuisolieren, was zu einer geringen Anzahl von Proben mit Wachstum, geringer Häufigkeit und geringer Diversitätführte 8. Diese Methode verbessert die Standardkulturpraktiken4,21 erheblich durch die Hinzufügung eines Anreicherungsschritts sowie eines neu …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung von P30 DK034854 unterstützte VY, LB und Studien im Massachusetts Host-Microbiome Center und die Finanzierung von NIH / NEI R01 EY022054 unterstützte MG.
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
Riferimenti
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