चूहों में कंजक्टिव कमेंसल आइसोलेशन और पहचान
Summary
यहां प्रस्तुत एरोबिक और संकाय एनारोबिक माउस कंजक्टिव कमेंसल बैक्टीरिया के अलगाव और प्रवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल है जो माइक्रोबायोलॉजिकल आधारित तरीकों और माल्डी-टीओएफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बाद की पहचान के साथ एक अद्वितीय आंख झाड़ू और संस्कृति आधारित संवर्धन कदम का उपयोग करके है।
Abstract
नेत्र सतह को एक बार प्रतिरक्षा विशेषाधिकार प्राप्त और अजैविक माना जाता था, लेकिन हाल ही में ऐसा लगता है कि एक छोटी, लेकिन लगातार अनुकूल उपस्थिति है। नेत्र म्यूकोसा में जीवाणु प्रजातियों की पहचान और निगरानी उनकी कम बहुतायत और कम विकास और पहचान के लिए उचित पद्धति की सीमित उपलब्धता के कारण चुनौतीपूर्ण रही है । दो मानक दृष्टिकोण हैं: संस्कृति आधारित या डीएनए अनुक्रमण विधियां। पहली विधि सीमित वसूली योग्य बैक्टीरिया के कारण समस्याग्रस्त है और दूसरा दृष्टिकोण जीवित और मृत बैक्टीरिया दोनों की पहचान करता है जिससे नेत्र अंतरिक्ष का एक गुमराह प्रतिनिधित्व होता है। हमने मानक माइक्रोबायोलॉजिकल संस्कृति तकनीकों पर निर्माण करके बैक्टीरियल अलगाव के लिए एक मजबूत और संवेदनशील विधि विकसित की है। यह एक झाड़ू आधारित तकनीक है, जो “इन-लैब” का उपयोग करते हुए पतली झाड़ू का उपयोग करता है जो निचले कंजक्टिवा को लक्षित करता है, जिसके बाद एरोबिक और संकाय एनारोबिक जेनेरा के लिए एक प्रवर्धन कदम होता है। इस प्रोटोकॉल ने हमें कोरिनेबैक्टीरियम एसपीपी, कोगुलास निगेटिव स्टेफिलोकोकस एसपीपी, स्ट्रेप्टोकोकस एसपीपीआदि जैसी कंजक्टिवल प्रजातियों को अलग-थलग करने और पहचानने की अनुमति दी है। दृष्टिकोण विभिन्न रोग की स्थिति के तहत चूहों में अनुकूल विविधता को परिभाषित करने के लिए उपयुक्त है।
Introduction
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य नेत्र माइक्रोबायोम की विशेषता के लिए नेत्र कंजक्टिवा से व्यवहार्य और दुर्लभ एरोबिक और संकाय एनारोबिक रोगाणुओं के विशिष्ट अलगाव को बढ़ाना है। व्यापक अध्ययनों ने त्वचा, आंत, श्वसन और जननांग तंत्र पर कॉमेंसल म्यूकोसल समुदायों को प्रोफाइल किया है और यह दर्शाता है कि ये समुदाय प्रतिरक्षा प्रणाली और प्रतिक्रिया1,2,3के विकास को प्रभावित करते हैं। कुछ रोग विकृतियों के दौरान नेत्र समुदाय समुदायों को बदलने के लिए दिखाया गया है, जैसे सूखी आंखों की बीमारी4,Sjogren सिंड्रोम5 और मधुमेह6। फिर भी, अन्य म्यूकोसल साइटों 6 ,7,8की तुलना मेंएक विशिष्ट नेत्र सतह अनुकूल समुदाय को परिभाषित करने की क्षमता उनकी अपेक्षाकृत कम बहुतायत से बाधित होती है। यह इस बात पर विवाद का संकेत देता है कि क्या निवासी नेत्र माइक्रोबायोम है और यदि यह मौजूद है, तो चाहे वह त्वचा माइक्रोबायोम से अलग हो और इसके परिणामस्वरूप, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास और प्रतिक्रिया पर इसका स्थानीय प्रभाव। यह प्रोटोकॉल इस प्रश्न को हल करने में मदद कर सकता है।
आम तौर पर, नेत्र हास्य आला को परिभाषित करने के दृष्टिकोण अनुक्रमण और संस्कृति आधारित तकनीकों4,7,9पर आधारित होते हैं। 16 एस rDNA अनुक्रमण और तेज विश्लेषण7 संस्कृति आधारित तकनीकों की तुलना में एक व्यापक विविधता दिखाने के लिए, लेकिन जीने और मृत रोगाणुओं के बीच अंतर करने में असमर्थ हैं । चूंकि नेत्र सतह आंसू फिल्म के एंटी माइक्रोबियल गुणों के कारण कई रोगाणुओं के लिए शत्रुतापूर्ण है4 डीएनए टुकड़े की एक बड़ी सरणी पैदा, डीएनए आधारित दृष्टिकोण इन कलाकृतियों जो निवासी commensals के रूप में मृत बैक्टीरिया की पहचान की ओर डेटा तिरछा हो सकता है बजाय संदूषकों का पता लगाने जाएगा । इसके परिणामस्वरूप सूक्ष्म जीव बहुतायत और विविधता10में अधिक होने के रूप में नेत्र अंतरिक्ष की पहचान और लक्षण वर्णन होता है । इससे डीएनए आधारित तरीकों के माध्यम से निवासी नेत्र माइक्रोबायोम को परिभाषित करना मुश्किल हो जाता है। जबकि, मानक संस्कृति आधारित तकनीकें commensals का पता लगाने में असमर्थ हैं क्योंकि लोड बहुत कम11है । हमारी विधि एक पतली झाड़ू है कि कंजक्टिवा को लक्षित कर सकते हैं का उपयोग करके मानक प्रथाओं पर सुधार, इस प्रकार पड़ोसी त्वचा से संदूषण से बचने, साथ ही अवधारणा है कि व्यवहार्य जीवों को पोषक तत्व घने मीडिया में संक्षिप्त संस्कृति द्वारा समृद्ध किया जा सकता है व्यवहार्य लेकिन गैर-कृषि योग्य, साथ ही, दुर्लभ व्यवहार्य रोगाणुओं के लिए समृद्ध ।
परिणाम, आंखों के झाड़ू के प्रति नेत्र commensals के सापेक्ष बहुतायत, कंजक्टिवा निवासी माइक्रोबायोम की विशेषता है और तुलनात्मक प्रयोजनों के लिए महत्वपूर्ण हैं । हमारे डेटा से पता चलता है कि त्वचा और कंजक्टिव माइक्रोबायोटा के बीच एक अंतर है, साथ ही बढ़ी हुई उम्र के साथ अधिक विविधता और बहुतायत में एक सेक्स विशिष्ट अंतर है । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण ने नॉक-आउट चूहों12में कमोरी अंतर पाया है। इस प्रोटोकॉल को नेत्र माइक्रोबायोम का वर्णन करने के लिए लागू किया जा सकता है जो कैगिंग प्रथाओं, भूगोल या रोग राज्य के साथ-साथ प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास और प्रतिक्रिया पर कॉमेंसल मेटाबोलाइट्स और उत्पादों के स्थानीय प्रभावों के कारण भिन्न हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
नेत्र सतह की कमी की स्थिति के कारण, कई प्रयोगशालाओं को नेत्र कॉमेंसल7,20को अलग करने में कठिनाई हुई है, जिसके परिणामस्वरूप विकास, कम बहुतायत और कम विविधतावालेनमूनों की संख्…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
P30 DK034854 से धन का समर्थन किया VY, पौंड और मैसाचुसेट्स मेजबान में अध्ययन-माइक्रोबायोम केंद्र और NIH/NEI R01 EY022054 से धन एमजी का समर्थन किया ।
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
Riferimenti
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. . Laboratory Experiments in Microbiology. , (2010).
- Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
- UK SMI. . Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus–a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
