Konjunktival commensal isolasjon og identifikasjon hos mus

Summary

Presentert her er en protokoll for isolering og forsterkning av aerob og fakultets anaerob mus konjunktivale kommensale bakterier ved hjelp av en unik øyepinne og kulturbasert berikelse trinn med påfølgende identifikasjon av mikrobiologiske baserte metoder og MALDI-TOF masse spektrometri.

Abstract

Den okulære overflaten ble en gang ansett som immunprivilegert og abiotisk, men nylig ser det ut til at det er en liten, men vedvarende commensal tilstedeværelse. Identifisering og overvåking av bakteriearter ved okulær slimhinne har vært utfordrende på grunn av deres lave overflod og begrensede tilgjengelighet av passende metodikk for commensal vekst og identifisering. Det er to standard tilnærminger: kulturbaserte eller DNA-sekvenseringsmetoder. Den første metoden er problematisk på grunn av de begrensede utvinnbare bakteriene, og den andre tilnærmingen identifiserer både levende og døde bakterier som fører til en avvikende representasjon av okulærrommet. Vi utviklet en robust og sensitiv metode for bakteriell isolasjon ved å bygge videre på standard mikrobiologiske kultiveringsteknikker. Dette er en vattpinnebasert teknikk, ved hjelp av en “in-lab” laget tynn vattpinne som retter seg mot nedre konjunktiv, etterfulgt av et forsterkningstrinn for aerob og fakultets anaerob slekt. Denne protokollen har gjort det mulig for oss å isolere og identifisere konjunktivale arter som Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. Tilnærmingen er egnet til å definere commensal mangfold hos mus under forskjellige sykdomstilstander.

Introduction

Målet med denne protokollen er å forbedre spesifikk isolasjon av levedyktige og sjeldne aerobe og fakultets anaerobe mikrober fra okulær konjunktiv for å karakterisere okulær mikrobiomet. Omfattende studier har profilert commensal mucosal samfunn på hud, tarm, luftveier og kjønnsorganer og viser at disse samfunnene påvirker utviklingen av immunsystemet og responsen^1,2,3. Okulære commensale samfunn har vist seg å endre seg under visse sykdomspatologier, for eksempel Tørr øyesykdom⁴, Sjogrens syndrom⁵ og diabetes⁶. Likevel er evnen til å definere et typisk okulært overflatekompmensalt samfunn hemmet av deres relativt lave overflod sammenlignet med de andre mucosalstedene^6,7,8. Dette fører til en kontrovers om hvorvidt det er et bosatt okulært mikrobiom og om det eksisterer, om det er forskjellig fra hudens mikrobiom og følgelig den lokale effekten på den medfødte immunsystemutviklingen og responsen. Denne protokollen kan bidra til å løse dette spørsmålet.

Generelt er tilnærminger for å definere okulær commensal nisje basert på sekvensering og kulturbaserte teknikker^4,7,9. 16 S rDNA-sekvensering og BRISK-analyse 7 viser et^bredere mangfold enn kulturbaserte teknikker, men klarer ikke å skille mellom levende og døde mikrober. Siden den okulære overflaten er fiendtlig innstilt til mange mikrober på grunn av tårefilmens antimikrobielle egenskaper⁴ som genererer et stort utvalg av DNA-fragmenter, vil DNA-baserte tilnærminger oppdage disse artefaktene som kan forskyve dataene mot identifisering av døde bakterier som bosatte commensals i stedet for forurensninger. Dette resulterer i avvikende commensal identifikasjon og karakterisering av okulærrommet som høyere i mikrobe overflod og mangfold¹⁰. Dette gjør det vanskelig å definere det beboende okulære mikrobiomet via DNA-baserte metoder. Standard kulturbaserte teknikker kan imidlertid ikke oppdage commensals fordi belastningen er for lav¹¹. Vår metode forbedrer standardpraksis ved å bruke en tynn vattpinne som kan målrette konjunktivene, og dermed unngå forurensning fra nærliggende hud, samt konseptet om at levedyktige organismer kan berikes av kort kultur i næringstett media med mål om å gjenopplive levedyktige, men ikke-kultiverbare, samt berike for sjeldne levedyktige mikrober.

Resultatene, relativ overflod av okulære commensals per øyepinne, karakteriserer konjunktiv bosatt mikrobiom og er viktige for komparative formål. Våre data viser at det er forskjell på hud og konjunktiv mikrobiota, samt større mangfold med økt alder og en kjønnsspesifikk forskjell i overflod. Videre har denne tilnærmingen reprodusert funnet commensal forskjeller i knock-out mus¹². Denne protokollen kan brukes til å beskrive okulært mikrobiom som kan variere på grunn av caging praksis, geografi eller sykdom tilstand, samt lokale effekter av commensal metabolitter og produkter på immunsystem utvikling og respons.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer mus følger retningslinjene fra Institusjonelt dyrepleie- og bruksutvalg. Følg laboratoriets sikkerhetsretningslinjer (som anvist av din institusjonelle miljøhelse- og sikkerhetsavdeling) når du arbeider med mikroorganismer og potensielt forurensede materialer. Bruk egnede avfallsbeholdere og dekontamineringsprosedyrer før avhending av potensielt biofarlige forurensede materialer. 1. Forberedelse av øyepinne, oppsett av arbeidsfelt, museøyeswabbing og prøveb…

Representative Results

Representative resultater for en øyepinneplate som demonstrerer forskjellige metoder for plating er avbildet i figur 3A som viser morfologiske forskjellige isolasjoner fra C57BL / 6 mus. For hver distinkt isolasjon ble koloniene telt i stripen og den relative overfloden, unike Colony Forming Units (CFUer) per øyepinne, beregnet og plottet for sammenligningsformål. For mikrobiologisk karakterisering ble bakterier plukket fra individuelle museøyepinneplater for å produsere en master TSA-p…

Discussion

På grunn av den paucibakterielle tilstanden til okulær overflate har mange laboratorier hatt problemer med å isolere okulære commensals^7,20, noe som resulterer i lavt antall prøver med vekst, lav overflod og lavt mangfold⁸. Denne metoden forbedrer standard kulturpraksis^{betydelig 4,21} ved å legge til et berikelsestrinn, samt en redesignet øyepinne og identifikasjon av MALDI-T…

Materials

0.1 to 10 µl pipet tip	USA Scientific	1110-300	autoclave before use
0.5 to 10 µl Eppendorf pipet	Fisher Scientific	13-690-026
1 ml syringe	Fisher Scientific	BD309623	1 syringe for each eye swab group
1.5 ml Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	autoclave before use
1000 µ ml pipet tip	USA Scientific	1111-2021	autoclave before use
200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000)	Fisher Scientific	F123602G
25 G needle	Fisher Scientific	14-826AA	1 needle per eye swab group
3 % Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	S25359
37 ° C Incubator	Lab equipment
70 % Isopropanol	Fisher Scientific	PX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml)	Santa Cruz Animal Health	SC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kit	Fisher Scientific	B12539
Bunsen Burner	Lab equipment
Clean paper towels	Lab equipment
Cotton Batting/Sterile rolled cotton	CVS
Disposable 1 ml Pipets	Fisher Scientific	13-711-9AM	for Gram stain and catalase tests
E.coli	ATTC	ATCC 8739
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	for Gram stain and catalase tests
Ketamine (100mg/ml)	Henry Schein	9950001
Mac Conkey Agar Plates	Fisher Scientific	4321270	store at 4 °C until ready to use
Mannitol Salt Agar	Carolina Biological Supply	784641	Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week
Mice	Jackson Labs	C57/BL6J
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-12	for Mannitol Salt agar plates
RPI Brain Heart Infusion Media	Fisher Scientific	50-488525	prepare according to directions and autoclave
SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	to sterilize anesthesia
Sterile Corning Centrifuge Tube	Fisher Scientific	430829	anesthesia preparation
Sterile mouse cage	Lab equipment
Tooth picks (round bamboo)	Kitchen Essentials		autoclave before use and swab preparation
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates	Fisher Scientific	4321261	store at 4 °C until ready to use
Vitek target slide	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrix solution	BioMerieux Inc. Durham, NC	411071
Single use eye drops	CVS Pharmacy		Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each