Isolamento e Identificação Conjuntivival Commensal em Camundongos
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento e amplificação de bactérias comensais anaeróbicas aeróbicas e facultativas de camundongos anastrérmicos utilizando um cotonete de olho único e passo de enriquecimento baseado em cultura com identificação subsequente por métodos à base microbiológica e espectrometria de massa MALDI-TOF.
Abstract
A superfície ocular já foi considerada imuno-privilegiada e abiótica, mas recentemente parece que há uma pequena, mas persistente presença commensal. A identificação e o monitoramento de espécies bacterianas na mucosa ocular têm sido desafiadores devido à sua baixa abundância e disponibilidade limitada de metodologia adequada para crescimento e identificação commensais. Existem duas abordagens padrão: métodos de sequenciamento de cultura ou sequenciamento de DNA. O primeiro método é problemático devido às bactérias recuperáveis limitadas e a segunda abordagem identifica bactérias vivas e mortas levando a uma representação aberrante do espaço ocular. Desenvolvemos um método robusto e sensível para o isolamento bacteriano, baseando-se em técnicas de cultivo microbiológico padrão. Trata-se de uma técnica baseada em swab, utilizando um cotonete fino “em laboratório” que visa a conjuntiva inferior, seguido por um passo de amplificação para genera aeróbico aeróbico e facultativo. Este protocolo nos permitiu isolar e identificar espécies conjuntivistas como Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. A abordagem é adequada para definir a diversidade commensal em camundongos em diferentes condições de doença.
Introduction
O objetivo deste protocolo é aumentar o isolamento específico de micróbios aeróbicos e anaeróbicos viáveis e facultativos da conjuntiva ocular para caracterizar o microbioma ocular. Estudos extensivos têm perfilado comunidades mucosas commensais nos tratos da pele, intestino, respiratório e genital e mostram que essas comunidades influenciam o desenvolvimento do sistema imunológico e a resposta1,2,3. Comunidades commensais oculares têm sido demonstradas para mudar durante certas patologias da doença, como doença do olho seco4, síndrome de Sjogren5 e diabetes6. No entanto, a capacidade de definir uma comunidade típica de superfície ocular commensal é dificultada por sua abundância relativamente baixa em comparação com os outros sítios mucosas6,7,8. Isso gera controvérsia sobre se existe um microbioma ocular residente e se ele existe, se ele difere do microbioma da pele e, consequentemente, seu efeito local sobre o desenvolvimento e resposta do sistema imunológico inato. Este protocolo pode ajudar a resolver essa questão.
Geralmente, as abordagens para definir o nicho commensal ocular baseiam-se no sequenciamento e nas técnicas baseadas na cultura4,7,9. 16 S rDNA sequenciamento e análise BRISK7 mostram uma diversidade mais ampla do que as técnicas baseadas na cultura, mas são incapazes de diferenciar entre micróbios vivos e mortos. Uma vez que a superfície ocular é hostil a muitos micróbios devido às propriedades antimicrobísis do filme lacrimal4 gerando uma grande variedade de fragmentos de DNA, abordagens baseadas em DNA detectarão esses artefatos que podem distorcer os dados para identificação de bactérias mortas como commensais residentes em vez de contaminantes. Isso resulta na identificação e caracterização aberrante do espaço ocular como sendo maior em abundância de micróbios e diversidade10. Isso dificulta a definição do microbioma ocular residente através de métodos baseados em DNA. Considerando que as técnicas padrão baseadas na cultura são incapazes de detectar commensais porque a carga é muito baixa11. Nosso método melhora as práticas padrão usando um cotonete fino que pode atingir a conjuntiva, evitando assim a contaminação da pele vizinha, bem como o conceito de que organismos viáveis podem ser enriquecidos por uma breve cultura em meios densos de nutrientes com o objetivo de ressuscitar viável, mas não cultural, bem como, enriquecer para micróbios viáveis raros.
Os resultados, abundância relativa de commensais oculares por cotonete ocular, caracterizam o microbioma residente conjuntiva e são importantes para fins comparativos. Nossos dados mostram que há uma diferença entre a pele e a microbiota conjuntivival, bem como maior diversidade com aumento da idade e diferença de sexo específico em abundância. Além disso, essa abordagem tem encontrado diferenças commensais em camundongosnocautes 12. Este protocolo pode ser aplicado para descrever o microbioma ocular que pode variar devido a práticas de caging, geografia ou estado de doença, bem como os efeitos locais de metabólitos commensais e produtos sobre desenvolvimento e resposta do sistema imunológico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido ao estado paucibacteriano da superfície ocular, muitos laboratórios têm tido dificuldade em isolar as commensals oculares7,20, resultando em baixo número de amostras com crescimento, baixa abundância e baixa diversidade8. Este método melhora significativamente as práticas de cultura padrão4,21 pela adição de uma etapa de enriquecimento, bem como um cotonete ocular …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento do P30 DK034854 apoiou a VY, LB e estudos no Massachusetts Host-Microbiome Center e financiamento do NIH/NEI R01 EY022054 apoiado MG.
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
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