Konjunktivval kommensal isolering och identifiering hos möss
Summary
Presenteras här är ett protokoll för isolering och förstärkning av aeroba och facultative anaeroba mus konjunktival kommensala bakterier med hjälp av en unik öga svabba och kultur-baserade anrikning steg med efterföljande identifiering av mikrobiologiska baserade metoder och MALDI-TOF massa spektrometri.
Abstract
Okulär ytan ansågs en gång immun privilegierad och abiotisk, men nyligen verkar det som om det finns en liten, men ihållande commensal närvaro. Identifiering och övervakning av bakteriearter vid okulär slemhinnan har varit utmanande på grund av deras låga överflöd och begränsade tillgänglighet av lämplig metodik för kommensal tillväxt och identifiering. Det finns två standardmetoder: kulturbaserade eller DNA-sekvenseringsmetoder. Den första metoden är problematisk på grund av de begränsade återvinningsbara bakterierna och det andra tillvägagångssättet identifierar både levande och döda bakterier som leder till en avvikande representation av det okulära utrymmet. Vi utvecklade en robust och känslig metod för bakteriell isolering genom att bygga vidare på standard mikrobiologiska odlingstekniker. Detta är en svabbbaserad teknik, med hjälp av en “in-lab” gjord tunn svabb som riktar sig mot den nedre bindhinnan, följt av ett förstärkningssteg för aeroba och fakultativa anaeroba släkten. Detta protokoll har gjort det möjligt för oss att isolera och identifiera konjunktival arter såsom Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. Tillvägagångssättet är lämpligt för att definiera kommensal mångfald hos möss under olika sjukdomsförhållanden.
Introduction
Syftet med detta protokoll är att förbättra specifik isolering av livskraftiga och sällsynta aeroba och facultative anaeroba mikrober från okulär bindhinnan att karakterisera okulär microbiome. Omfattande studier har profilerat commensal slemhinnor på huden, tarmen, luftvägarna och könsorganen och visar att dessa samhällen påverkar utvecklingen av immunsystemet ochsvar 1,2,3. Okulär commensal samhällen har visat sig förändras under vissa sjukdom patologier, såsom Torra ögonsjukdom 4, Sjögrens syndrom5 och diabetes6. Ändå hämmas förmågan att definiera en typisk okulär yta commensal gemenskap av deras relativt låga överflöd jämfört med de andra slemhinnor6,7,8. Detta leder till en kontrovers om huruvida det finns ett resident okulärt mikrobiom och om det finns, om det skiljer sig från hudens mikrobiom och följaktligen dess lokala effekt på det medfödda immunsystemets utveckling och svar. Det här protokollet kan hjälpa till att lösa den här frågan.
I allmänhet är metoder för att definiera den okulära commensal nischen baserade på sekvensering och kulturbaserade tekniker4,7,9. 16 S rDNA-sekvensering och BRISK-analys7 visar en bredare mångfald än kulturbaserade tekniker, men kan inte skilja mellan levande och döda mikrober. Eftersom den okulära ytan är fientlig mot många mikrober på grund av att tårfilmens antimikrobiellaegenskaper 4 genererar ett stort antal DNA-fragment, kommer DNA-baserade metoder att upptäcka dessa artefakter som kan skeva data mot identifiering av döda bakterier som bosatta commensals snarare än föroreningar. Detta resulterar i avvikande kommensal identifiering och karakterisering av det okulära utrymmet som högre i mikrob överflöd och mångfald10. Detta gör det svårt att definiera det bosatta okulära mikrobiomet via DNA-baserade metoder. Standardkulturbaserade tekniker kan inte upptäcka commensals eftersom belastningen är för låg11. Vår metod förbättrar standardpraxis genom att använda en tunn svabb som kan rikta in sig på bindhinnan, vilket undviker förorening från närliggande hud, liksom konceptet att livskraftiga organismer kan berikas av kort kultur i näringsrika täta medier med målet att återuppliva livskraftiga men icke-odlingsbara, liksom berikande för sällsynta livskraftiga mikrober.
Resultaten, relativa överflöd av okulär commensals per öga svabb, karakterisera bindhinnan bosatta mikrobiom och är viktiga för jämförande ändamål. Våra data visar att det finns en skillnad mellan hud och konjunktival mikrobiota, liksom större mångfald med ökad ålder och en könsspecifik skillnad i överflöd. Dessutom har detta tillvägagångssätt reproducerbart funnit kommensala skillnader i knockout möss12. Detta protokoll kan tillämpas för att beskriva okulär mikrobiom som kan variera på grund av lokaliseringsmetoder, geografi eller sjukdomstillstånd, liksom de lokala effekterna av kommensala metaboliter och produkter på immunsystemets utveckling och svar.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av den okulära ytans paucibacterial tillstånd har många laboratorier haft svårt att isolera okulär commensals7,20, vilket resulterar i lågt antal prover med tillväxt, lågt överflöd och låg mångfald8. Denna metod förbättrar avsevärt standardkulturpraxis4,21 genom att lägga till ett anrikningssteg, samt en omdesignad ögonvabb och identifiering av MALDI-TOF …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering från P30 DK034854 stödde VY, LB och studier i Massachusetts Host-Microbiome Center och finansiering från NIH / NEI R01 EY022054 stödde MG.
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
Riferimenti
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. . Laboratory Experiments in Microbiology. , (2010).
- Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
- UK SMI. . Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus–a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
