Her beskriver vi protokoller til udførelse af levende billeddannelse og kvantitativ analyse af kemotiltrækningsreceptordynamik i zebrafisk neutrofiler
Leukocytvejledning ved kemiske gradienter er afgørende for immunresponser. Neutrofiler er de første celler, der rekrutteres til steder med vævsskade, hvor de udfører vigtige antimikrobielle funktioner. Deres handel med disse loci er orkestreret af flere inflammatoriske kemotiltraptanter, herunder kemokiner. På molekylært niveau reguleres kemotatraktant signalering ved intracellulær handel med de tilsvarende receptorer. Det er dog stadig uklart, hvordan subcellulære ændringer i kemokinreceptorer påvirker leukocytmigrationsdynamikken på celle- og vævsniveau. Her beskriver vi en metode til levende billeddannelse og kvantitativ analyse af kemokinreceptordynamikken i neutrofiler under inflammatoriske reaktioner på vævsskade. Disse værktøjer har afsløret, at differentiel kemokinreceptorhandel med zebrafisk neutrofiler koordinerer neutrofil klyngedannelse og spredning på steder med vævsskade. Dette har konsekvenser for vores forståelse af, hvordan inflammatoriske reaktioner er selvopløste. De beskrevne værktøjer kunne bruges til at forstå neutrofile migrationsmønstre i en række fysiologiske og patologiske indstillinger, og metoden kunne udvides til andre signalreceptorer.
Leukocytmigration er af afgørende betydning for immunresponser. Immunceller er prototypiske vandrende celler, som er bemærkelsesværdigt i stand til at krydse væv og blodkar og fornemme en række kemiske vejledningssignaler for at migrere retningsbestemt mod mikrober eller andre værtsceller af betydning. Korrekt vejledning er afhængig af anerkendelse af kemotiltrentriva, blandt hvilke kemokiner repræsenterer den mest fremtrædende kategori1. Kemokiner genkendes af meget specifikke syv-transmembranE G-proteinkoblede receptorer. Ved kemokinbinding ændrer kemokinreceptorer konformation, hvilket fører til aktivering af associerede trimere G-proteiner og deres dissociation i funktionelle signalunderenheder, der fremmer cytoskeletale ændringer og rettet migration1. Sekundært fosforyleres kemokinreceptorer, og denne modifikation fører til desensibilisering over for tiltrækningsmiddel, som kan efterfølges af hurtig resensibilisering /genanvendelse eller intracellulær nedbrydning og nedregulering fra celleoverfladen2. Disse receptordynamikker påvirker varigheden og dosis af signalering modtaget af cellerne, men hvordan de påvirker leukocytmigrationsadfærd har været vanskeligt at belyse in vivo.
Sporing af receptordynamik i levende leukocytter i traditionelle pattedyrssystemer står over for flere udfordringer. Til levende undersøgelser skal receptorfusioner med fluorescerende proteiner udtrykkes i cellerne. Dette er udfordrende i primære leukocytter, især i neutrofiler, og undersøgelser har hidtil brugt surrogatnetrofile cellelinjer til at udtrykke kemokinreceptorer 3,4. Generering af transgene musemodeller, hvor leukocytter udtrykker en fluorescerende receptor eller mutantreceptorer med informative trafficking-defekter 5,6, indebærer en betydelig investering af tid og ressourcer. Selv i disse tilfælde kan billeddannelsesopløsningen og kontrasten for billeddannelsesreceptordynamikken i det levende dyr begrænses, og undersøgelser har anvendt immunhistokemi på faste vævsafsnit5. I betragtning af disse tekniske udfordringer er vores forståelse af, hvordan kemotiltrækreceptordynamikken påvirker celleadfærd i en levende vævsindstilling, i øjeblikket begrænset.
Her giver vi en metode til at overvåge receptorhandel med zebrafisk neutrofiler. Zebrafisk er genetisk trækbare, ligesom mus, men transgenese er relativt mere ligetil ved brug af effektive transposonsystemer og direkte zygote manipulation7. Den gennemsigtige larve er ideelt tilgængelig til billeddannelse. Kemokinreceptordynamikken er blevet visualiseret i primordiale kimceller og sidelinjen primordium ved ekspression af tilsvarende fusioner med fluorescerende reportere 8,9,10. Zebrafisklarver er udstyret med modne neutrofiler, der har stærkt bevarede genetiske og cellulære egenskaber med hensyn til pattedyrs neutrofiler. Subcellulær signaldynamik såsom cytoskeletal dynamik og polaritetsregulatorer er blevet visualiseret i disse celler ved generering af tilsvarende transgene linjer 11,12,13. For nylig visualiserede og funktionelt analyserede vi kemokinreceptordynamikken i neutrofiler i løbet af inflammatoriske reaktioner på vævsskade14. Her beskriver vi genereringen af transgene reporterlinjer til kemokinsignalering i neutrofiler, forberedelse af embryoner til levende billeddannelse, et sårassay til undersøgelse af neutrofilsignalering og protokollen til erhvervelse og analyse af billeder. Vi leverer også en sideprotokol til test af kemokinreceptorresponser på kandidatligander, hvilket er nyttigt, når man forsøger at etablere ligandgenkendelsesmønstre i ukarakteriserede receptorer. Disse teknikker kan anvendes i kombination med yderligere genetiske manipulationer, såsom hæmning af endogen kemokinekspression eller generering af mutantreceptorer med ændret ligandinduceret handel, for at forhøre, hvordan specifik signaldynamik påvirker leukocytadfærd in vivo. De transgene linjer, der udtrykker fluorescerende mærkede kemokinreceptorer, kan også bruges som reportere for endogene kemokingradienter, som ellers er vanskelige at detektere ved direkte antistoffarvning. Den beskrevne metode giver mulighed for at udvide genereringen af indberettere til andre immunsignalreceptorer.
Den beskrevne metode tillader levende billeddannelse af receptordynamik som reaktion på endogene ligander in situ under et inflammatorisk respons på vævsskade. Brugen af Cxcr1/Cxcr2 neutrofile indberettere kan udvides til andre fysiologiske indstillinger, såsom infektion, tumormodeller eller andre former for vævsskade 14,25,26,27. Derudover kan transgene redningslinjer, hvor den endogene receptor undertrykkes og reddes af en eksogen mutantreceptor, give nyttige værktøjer til at dissekere betydningen af specifikke neutrofile migrationsmønstre i immunresponser. For eksempel forårsager Cxcr1-receptormutanter, der har nedsat desensitisering, mere fremtrædende neutrofil klyngedannelse på inflammatoriske steder14. Denne gevinst af funktion fænotype kan bruges til at forstå neutrofilmenighedens rolle i forskellige fysiologiske processer, f.eks. sårreparation, infektionssygdom eller tumorudvikling og komplementere receptor knockdown / knockout-eksperimenter. Metoden giver også grundlag for at udvide rækken af tilgængelige indberettere. Valget af fluorescerende reporter er vigtigt at overveje og afhænger af det biologiske spørgsmål. Vi fandt ud af, at den konstitutive omsætning af disse kemokinreceptorer i neutrofiler var høj sammenlignet med epitelceller, og at journalister med hurtig modning (f.eks. sfGFP) var forpligtet til at rapportere membranniveauer i stabil tilstand og løse forskelle ved neutrofilstimulering 8,14. Således er membranforholdet mellem sfGFP / tagRFP ikke anvendeligt til måling af ligandinduceret internalisering i denne celletype, men mønsteret af tagRFP tillader sporing af receptorens intracellulære skæbner, hvilket kan være nyttigt i nogle undersøgelser. Vi fandt også, at det mere koncentrerede intracellulære signal fra tagRFP er nyttigt til screening af individuelle larver. En alternativ metode til måling af receptorniveauer ved plasmamembranen ville være at co-udtrykke en fluorescerende membranmarkør i neutrofiler enten i det samme transgen9 eller i et uafhængigt transgen14. I førstnævnte scenarie ville transgenet udgøre et yderligere middel til screening af fiskene, og ekspressionsniveauerne ville være sammenlignelige mellem markøren og receptoren. Sidstnævnte tilgang ville være mere modulær, idet en zebrafiskelinje med en receptorreporter kunne kombineres med forskellige reporterlinjer. I begge tilfælde er det værd at bemærke, at membrankvantificering af receptorniveauerne er udfordrende i klyngede neutrofiler (se nedenfor). Endelig bemærker vi, at en mulig udvidelse af denne protokol ville være at følge op på den levende billeddannelse ved hjælp af immunhistokemi for mere detaljerede lokaliseringsanalyser.
Tol2-transgenesesystemet er veletableret7, og lysozym C-promotoren er blevet anvendt i vid udstrækning til neutrofilekspression11,15. Transgenesetilgangen er derfor relativt ligetil, og ekspressionsniveauet opnået med denne promotor er højt nok til at give tilstrækkelig kontrast til analyse af receptordynamik. En mulig begrænsning er, at ekspressionsniveauet ikke rekapitulerer endogene receptorekspressionsniveauer. Nye CRISPR-teknologier kan anvendes til at etablere knock-in-linjer for receptorer af særlig interesse28. Disse teknologier er stadig besværlige og garanterer muligvis ikke de krævede ekspressionsniveauer for subcellulær billeddannelse, men deres vellykkede udvikling ville være et vigtigt gennembrud for forståelsen af endogen signaldynamik. Funktionelle valideringer er vigtige for fortolkning af data med transgene receptorkonstruktioner. For eksempel kan ligandgenkendelsesassays bruges til at fastslå, at det fluorescerende fusionsprotein er funktionelt, og redning af knockout-fænotyper kan bruges til at fastslå, at de transgene neutrofile ekspressionsniveauer er kompatible med funktionalitet14. Endelig ville en mere direkte måde at validere receptorfusionen på være at anvende et in vitro-funktionelt assay med mærket receptor sammen med ikke-mærkede versioner14.
Kvantificeringsmetoden adresserer specifikke vanskeligheder med nøjagtig membransegmentering i neutrofiler in vivo. I celler af epitelmæssig karakter kan kvantificering af receptorniveauer udføres automatisk ved at normalisere membranreceptorniveauer til en kontrolmarkør, som kan udtrykkes i tandem eller separat9. Faktisk har vi anvendt en sådan tilgang, når vi bruger ligandgenkendelsesassayet i gastrulerende embryoner14. Imidlertid gennemgår neutrofiler komplekse, hurtige ændringer i celleform in vivo, hvilket gør membransegmenteringen vanskelig både i 2D og 3D14. Dette er endnu mere udfordrende, når neutrofiler klynger sig, hvilket forekommer i mange fysiologiske omgivelser29. Kontrastmetrikken overvinder denne begrænsning, da den ikke kræver membransegmentering, men i stedet afspejler den overordnede tilstand af receptorfordeling i cellen (membranøs / glat vs vesikulær / prikket). Det er vigtigt at bemærke, at kontrastmetrik kan påvirkes af billedets overordnede kontrast, så normalisering af individuelle celleværdier til en intern reference er nødvendig for at tage højde for signalets variabilitet i forskellige embryoner / prøver. For eksempel brugte vi den gennemsnitlige cellekontrastværdi af ikke-responsive neutrofiler i CHT (dvs. neutrofiler, der forbliver stationære og ikke migrerer ind i den ventrale fin)14. En yderligere mulighed ville være at normalisere med kontrastværdier af en kontrolmarkør i samme celle. Dette ville give en løsning, når en intern reference af ikke-responderende celler ikke er tilgængelig og kan sandsynligvis løse finere kvantitative forskelle i receptordynamik mellem forskellige forhold.
Placeringen af billeddannelse er en anden variabel at overveje. Årsagen til at vælge det ventrale finnesår her, i modsætning til den mere almindeligt anvendte halefinnesårmodel16,30, er fordi sårstedet ligger i nærheden af stedet for neutrofil bopæl / migrerende oprindelse. Dette fremskynder tidslinjen for analysen, da det tager relativt lidt tid for neutrofiler at ankomme. Derudover giver det mulighed for at fange celleadfærd både ved migrationsoprindelsen (CHT) og målplaceringen af interesse (såret). Dette er relevant her, fordi den rumlige og tidsmæssige opløsning, der kræves til subcellulær billeddannelse, er vanskelig at kombinere med et stort synsfelt eller scanning med flere positioner. Således tillader det ventrale finsårassay sporing af udviklingen af det migrerende respons fra migrationsoprindelsen og samtidig indfangning af uspecifikke receptorudsving i celler, der ikke reagerer. Som nævnt ovenfor er sidstnævnte nyttig til kvantificeringsformål, da den giver en intern reference for uspecifik dynamik. I andre systemer er det muligvis ikke muligt at have en sådan intern reference, i hvilket tilfælde kontrastværdierne for en co-udtrykt membranmarkør ville give en alternativ kontrol.
Sammenfattende forventer vi, at metoden kan anvendes på andre systemer og kan implementeres til en række forskellige formål. For eksempel kan de samme journalister bruges i andre inflammatoriske indstillinger, såsom infektionsindstillinger eller andre sygdomsmodeller. Repertoiret af zebrafiskreceptor reporterlinjer kunne udvides til andre signalreceptorer for at forstå signalmekanismer eller rapportere liganddynamik in vivo. Tilgangen kan kombineres med knockdown/knockout teknikker til at forhøre det mekanistiske grundlag for observeret dynamik. For eksempel kan forstyrrelse af ligandekspression indikere ligandafhængigheden for observeret receptordynamik. I fremtiden forestiller vi os, at systemet kan forbedres yderligere for at indarbejde indsættelse af journalister. I sidste ende vil resultater, der bruger denne metode, give ny indsigt, der er værdifuld ud over zebrafiskesamfundet, i betragtning af bevarelsen af disse signalreceptorer hos pattedyr og den relative udfordring ved at gennemføre disse undersøgelser i større organismer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Christine Holt og Bill Harris for hjælp med konfokalmikroskopi. Vi takker Darren Gilmour for de fluorescerende timer-rygradskonstruktioner og Anna Huttenlocher for Tol2-Lyz-rygradsvektoren. Vi takker Steve Renshaw for Tg(mpx:GFP)i114-linjen . Dette arbejde blev støttet af MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] og et Isaac Newton Trust-tilskud 19.23(n). C.C. blev støttet af et MRC DTP-studieopmål og delvist af Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] tilskud. H.W. blev støttet af et MRC DTP Studentship. H.P. blev støttet af et Wellcome Trust ph.d.-stipendium (105391/Z/14/Z) og dels af en Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] tilskud og MRC (MR/L019523/1).
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |