Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Subretinal transplantation af humant embryonalt stamcelleafledt nethindevæv i en kattemodel med store dyr

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/61683
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1
1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenteres en kirurgisk teknik til transplantation af humant pluripotent stamcelle (hPSC)-afledt nethindevæv ind i det subretinale rum i en stor dyremodel.

Abstract

Retinal degenerative (RD) tilstande forbundet med fotoreceptor tab såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) og Leber medfødt amaurose (LCA) forårsage progressivt og invaliderende synstab. Der er et udækket behov for terapier, der kan genoprette synet, når fotoreceptorer er gået tabt. Transplantation af humant pluripotent stamcelle (hPSC)-afledt nethindevæv (organoider) ind i øjets subretinale rum med avanceret RD bringer retinale vævsplader med tusindvis af sunde mutationsfrie fotoreceptorer og har potentiale til at behandle de fleste / alle blændende sygdomme forbundet med fotoreceptordegeneration med en godkendt protokol. Transplantation af føtalt nethindevæv i det subretinale rum af dyremodeller og mennesker med avanceret RD er udviklet med succes, men kan ikke bruges som rutinemæssig terapi på grund af etiske bekymringer og begrænset vævsforsyning. Store øjne arvelig retinal degeneration (IRD) dyremodeller er værdifulde til udvikling af synsgendannelsesterapier ved hjælp af avancerede kirurgiske tilgange til transplantation af retinale celler / væv i det subretinale rum. Lighederne i klodens størrelse og fotoreceptorfordeling (f.eks. tilstedeværelse af makulalignende region area centralis) og tilgængeligheden af IRD-modeller, der nøje rekapitulerer human IRD, ville lette hurtig oversættelse af en lovende terapi til klinikken. Her præsenteres en kirurgisk teknik til transplantation af hPSC-afledt nethindevæv i det subretinale rum i en stor dyremodel, der muliggør vurdering af denne lovende tilgang i dyremodeller.

Introduction

Millioner af mennesker rundt om i verden er påvirket af retinal degeneration (RD) med deraf følgende synshandicap eller blindhed forbundet med tab af lysfølsomme fotoreceptorer (PR'er). Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) er en væsentlig årsag til blindhed som følge af en kombination af genetiske risikofaktorer og miljø- / livsstilsfaktorer. Derudover har over 200 gener og loci vist sig at forårsage arvelig RD (IRD)1. Retinitis pigmentosa (RP), den almindeligste IRD, er genetisk heterogen med mere end 3.000 genetiske mutationer i ca. 70 gener, der rapporteres 2,3,4. Leber medfødt amaurose (LCA), som forårsager blindhed i barndommen, er også genetisk heterogen 5,6. Genforstørrelsesterapi er udviklet og er i kliniske forsøg til behandling af et lille antal IRD'er 3,7. Der skal imidlertid udvikles en separat terapi til behandling af hver enkelt genetisk form af IRD og derved kun behandling af en lille delmængde af patienter. Desuden er genforstærkning afhængig af tilstedeværelsen af en population af reddelige fotoreceptorer og er derfor ikke anvendelig til avanceret degeneration.

Der er derfor et presserende og endnu uopfyldt klinisk behov for udvikling af terapier, der adresserer og behandler avancerede RD'er og dyb til terminal blindhed. I løbet af de sidste 2 årtier er neuroprotetiske implantater blevet udviklet og testet i store dyremodeller, såsom katten, før human brug 8,9,10,11,12,13,14. Ligeledes er der i de sidste 20 år retinale erstatningsterapier ved hjælp af ark af embryonale eller endda modne pattedyrs nethinden podet subretinalt blevet udviklet 15,16,17,18,19,20,21,22 og endda testet med succes hos RD-patienter 23,24,25. Begge tilgange udnytter ideen om at introducere nye sensorer (fotovoltaiske siliciumfotodioder i tilfælde af neuroprotetiske enheder26,27 og sunde mutationsfrie fotoreceptorer organiseret i ark, i tilfælde af implantation af nethinden) i nethinden med degenererede PR'er. Nylige undersøgelser har undersøgt brugen af stamcellebaserede tilgange såsom transplantation af humane pluripotente stamceller (hPSC)-afledte retinale forfædre28,29, hPSC-fotoreceptorer 30 og hPSC-retinale organoider31,32,33. Retinale organoider muliggør dannelse af retinal væv i en skål og afledning af fotoreceptorark med tusindvis af mutationsfrie PR'er, der ligner fotoreceptorlaget i den udviklende humane føtale nethinde 34,35,36,37,38,39,40 . Transplantation af hPSC-afledt nethindevæv (organoider) i det subretinale rum hos patienter med RD-tilstande er en af de nye og lovende undersøgelsescelleterapimetoder, der forfølges af en række hold31,32,41,42. Sammenlignet med transplantation af cellesuspensionen (af unge fotoreceptorer eller retinale forfædre) blev transplanterede ark af føtale fotoreceptorer påvist at resultere i synsforbedringer i kliniske forsøg23,24.

Protokollen, der præsenteres her, beskriver detaljeret en transplantationsprocedure for subretinal levering af hele retinale organoider (snarere end organoide fælge33,41) som en potentielt bedre måde at introducere intakte retinale ark med PR'er for at øge transplantatoverlevelsen og forbedre arkbevarelsen. Selvom procedurer for indførelse af et fladt stykke menneskelig nethinden og også RPE-patches er blevet udviklet43,44,45, er transplantation af større 3D-transplantater ikke blevet undersøgt. Stamcelleafledte retinale organoider giver en uudtømmelig kilde til fotoreceptorark til udvikling af synsgendannelsesteknologier, er fri for etisk begrænsning og betragtes som en fremragende kilde til humant nethindevæv til terapier med fokus på behandling af avanceret RD og terminal blindhed46. Udvikling af kirurgiske metoder til præcis subretinal implantation af retinale organoider med minimal skade på værtsnethindenichen (neural nethinde, retinal pigmentepitel og retinal og choroidal vaskulatur) er et af de kritiske trin for at fremme en sådan behandling mod kliniske anvendelser31,32. Store dyremodeller som katte, hunde, grise og aber har vist sig at være gode modeller til at undersøge kirurgiske leveringsmetoder samt til at demonstrere sikkerheden af implanterede vævsplader (retinale pigmentepitel (RPE) celler) og undersøge brugen af organoider 41,44,45,47,48,49,50 . Det store dyreøje har en lignende klodestørrelse som menneskelig såvel som lignende anatomi, herunder tilstedeværelsen af et område med høj fotoreceptortæthed, herunder kegler (området centralis), der ligner den menneskelige macula 6,51,52.

I dette manuskript beskrives en teknik til implantation af hPSC-afledt nethindevæv (organoider) i det subretinale rum hos store kattemodeller (både vildtype- og CrxRdy/+-katte), som sammen med lovende effektresultater32,53 bygger et fundament for yderligere udvikling af sådan forsøgsbehandling mod kliniske anvendelser til behandling af RD-tilstande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedurerne blev udført i overensstemmelse med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) erklæring for brug af dyr i oftalmisk og synsforskning. De blev også godkendt af Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. Vildtype- og CrxRdy/+ -katte fra en koloni af katte, der blev opretholdt ved Michigan State University, blev brugt i denne undersøgelse. Dyrene blev opstaldet under 12 timer: 12 timers lys-mørke cyklusser og fodret med en kommerciel komplet kattediæt.

1. Præimplantationsprocedurer og kirurgisk opbygning

  1. Vælg vildtype- eller CrxRdy/+ -katte afhængigt af undersøgelsesdesignet. Udfør en prækirurgisk oftalmisk undersøgelse, herunder spaltelampebiomikroskopi og indirekte oftalmoskopi. Ekskluder dyr med fundusabnormiteter, der ikke er relateret til deres genotyper.
  2. En uge før implantation startes dyrene på en immunsuppressiv protokol med oral ciclosporin 2 mg/kg og prednisolon 1 mg/kg, begge to gange dagligt for at forhindre afstødning af transplantationen.
  3. Fastgør dyrene over 4 måneder natten over (mindst 8 timer). Giv en begrænset mængde vådfoder natten over til dyrene under 4 måneder, og fastk dem derefter i 2 timer før operationen.
  4. Udfør en generel fysisk undersøgelse, herunder brystauskultation (ved hjælp af et stetoskop). Optag hjerte- og respirationsfrekvens, temperatur, slimhindefarve og kapillær genopfyldningstid.
  5. Præmedicinere dyr under 4 måneder med buprenorphin (0,02 mg/kg) og dyr over 4 måneder med buprenorphin (0,02 mg/kg) kombineret med acepromazin (0,02 mg/kg) subkutant eller intramuskulært 30-45 minutter før induktion af generel anæstesi.
  6. Påfør topisk 1% tropicamid oftalmisk opløsning og 10% phenylephrin oftalmisk opløsning på den okulære overflade mindst to gange for at udvide pupillerne. Gentag, hvis pupillerne ikke er godt udvidede.
  7. Anbring et 22 G intravenøst kateter i cephalvenen hos alle dyrene: klip først hår fra et område på 2 x 3 cm over cephalic venen; forberede huden ved først at skrubbe den med 70% ethanol og derefter med en chlorhexidinskrubbe; Placer kateteret og fastgør med medicinsk tape og skyl med hepariniseret saltvand. Hos dyr under 4 måneder kan dette gøres efter induktion af anæstesi.
  8. Inducer generel anæstesi 30-45 minutter efter præmedicinering: dyr under 4 måneder induceres med isofluran leveret med maske, de over 4 måneder induceres ved hjælp af intravenøs propofol (4-6 mg / kg).
  9. Intubat med en passende størrelse endotrakealt rør. Visualiser strubehovedet med et undersøgelseslys eller laryngoskop. Spray 0,1 ml lidokain 2% på strubehovedet, vent et par sekunder og intuber derefter.
  10. Bevar anæstesi med isofluran (mellem 2% -3,5%) i ilt (300-600 ml / kg / min) via et Bain-system.
  11. Placer dyret i dorsal liggende på en positioneringspude, hvorpå et opvarmet vandtæppe dækket af håndklæder er placeret. Vedhæft en patientmonitor og overvåg puls og elektrokardiogram (EKG), respirationsfrekvens, blodtryk, iltmætning og slutvandskuldioxid. Overvåg regelmæssigt kropstemperaturen under proceduren. En passende uddannet person er ansvarlig for vedligeholdelse og overvågning af anæstesi.
  12. Placer dyret ved hjælp af positioneringspuden, således at hornhindeoverfladen er vandret, når øjet drejes til en primær blikposition. Fastgør hovedet på plads ved hjælp af medicinsk tape.
  13. Dæk dyret med tæpper for at hjælpe med at opretholde kropstemperaturen.
  14. Det intravenøse kateter skylles med hepariniseret saltvand, og en intravenøs infusion af Ringer-laktat, der leveres ved 2-5 ml/kg/t under hele proceduren.
  15. Forbered den okulære overflade, konjunktivalsækken og øjenlågene til aseptisk kirurgi ved hjælp af 0,2% povidon-jod, sterile vatpindapplikatorer og bomuldskugler.
  16. Placer operationsmikroskopet med okularer, der også er justeret korrekt. Placer fodkontrollen til mikroskopet (fokus, zoom og XY-aksekontrol) og vitrektomimaskinen, så kirurgen kan betjene dem.
  17. Forbered dig på aseptisk kirurgi: Alt personale skal bære kirurgisk skrubber, en kirurgisk hat og en maske. Sørg for, at kirurgen og assistenten (e) skrubbe, kjole og handske som ved rutinemæssig aseptisk kirurgi. Alt personale skal være bekendt med aseptiske teknikker.
  18. Når personalet er skrubbet, klædt og handsket, skal du åbne de kirurgiske pakker og lægge instrumenterne ud. Placer sterile manipulationsknapper på mikroskopets justeringsknapper for at give kirurgen eller assistenten mulighed for at justere uden at bryde asepsis. Drape dyret rutinemæssigt til okulær kirurgi.
  19. Forbered vitrektomimaskinen ved at følge producentens anvisninger for en to-port vitrektomi.
    1. Placer en vitrektomikontaktlinse og to port 23 G vitrektomi på assistentens bord. Fastgør det våde felt cautery. Fastgør og klargør infusionsslangen og 23 G vitrektomihåndstykket.
    2. Placer vitrektomiinstrumenterne og væskeledningerne over det sterile gardin, og hold dem på plads ved hjælp af håndklædeklemmer. Indstil vitrektomimaskinen i proportionalvakuumtilstand mellem 1.500 og 2.500 snit pr. minut (cpm) og maksimalt vakuum på 500 mmHg. Dette udføres ved at trykke på pileknapperne (opad eller nedad), der findes på frontpanelet på vitrektomimaskinen.

2. Forberedelse af organoiderne til subretinal implantation (figur 1)

  1. Der udledes retinale organoider som beskrevet tidligere31, og send om nødvendigt natten over ved 37 °C som tidligere rapporteret54.
  2. Tør overfladerne i vævskulturrummet i det modtagende laboratorium af med et desinfektionsmiddel, og oprethold det samme høje niveau af aseptisk teknik som i en kirurgisk suite til øjenoperationer for at undgå bakteriel eller svampekontaminering, og overfør til operationsrummet for at undgå infektion på operationsstedet.
  3. Brug kirurgiske skoovertræk, engangslaboratoriefrakker, motorhjelme, kirurgiske masker, ærmer og kirurgiske skrubber inde i vævskulturrummet, der er tildelt organoidforberedelse til okulære operationer.
  4. Pre-equilibrer neurale medier med 20 ng/ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) og 20 ng/ml hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) i 1 time i en vævskulturinkubator (37 °C, 5% CO2). Organoider anbringes i medier i plader med ultralav vedhæftning med ca. en fjerdedel af konditioneringssubstratet (fra dag-til-dag-forsendelsen) og tre fjerdedele frisk substrat31,54. Vedligehold i 24-48 timer.
  5. Flere friske 60 mm plader fremstilles og ligevægtes med neurale substrater (som forberedt i trin 2.4) i mindst 1 time i vævskulturkuvøsen (37 °C, 5 % CO2), før det første dyr bedøves. Bemærk, at disse plader bruges til overførsel af organoiderne til hver enkelt operation med en antagelse om, at pH-betingelser og CO2 mætning opretholdes i medierne i mindst 20 minutter, hvilket er tilstrækkeligt til at flytte pladen til operationsrummet og indlæse organoider i kanylen.
  6. Der anvendes en frisk 60 mm plade med formættede neurale medier til hvert transplantationstilfælde, mens de resterende plader opbevares i vævskulturkuvøsen ved 37 °C.
  7. Overfør 6-9 organoider til en 60 mm skål (med genmættet medie) ved at pipettere dem ud med en manuel enkeltkanalpipette (20–200 μL) med 200 μL steril filterspids med en bred (~0,7 mm) åbning. Disse tip kan tilberedes på forhånd eller under proceduren ved at klippe ~ 3-4 mm af spidsen af med en steril saks (udført i vævskulturhætten for at undgå forurening). Anbring 60 mm skålen i en 100 mm vævskulturskål (for at undgå kontaminering under rum-til-rum-transport) og transporter den hurtigt til operationsstuen.
  8. Pladen med organoider anbringes på en 37 °C elektrisk varmepude dækket af et sterilt gardin.
  9. Skift til et par friske sterile handsker, inden organoiderne klargøres.
  10. Organoiderne skylles i steril afbalanceret saltopløsning (BSS) (valgfrit), og hældes derefter i injektoren, som består af en tyndvægget borosilikatglaskanyle (udvendig diameter, OD 1,52 mm; indvendig diameter, ID 1,12 mm) med en poleret stump ende fastgjort med steril plastslange til en steril 500 μL Hamilton-sprøjte, der er fyldt med steril BSS.
  11. Send kanylen til det kirurgiske team på en steril måde, når de er klar til at injicere organoiderne.
  12. Hold længden af hele proceduren (fra fjernelse af organoiderne fra vævskulturmedier til ilægning af kanylen) til 20 minutter eller mindre.
  13. Hvis der er en forsinkelse i implantering af organoiderne, skal du placere dem tilbage i vævskulturinkubatoren for at undgå ændringer i pH / CO2 mætning inde i skålen.
  14. Opbevar ubrugte organoider i 1 uge i samme vævskulturinkubator og overvåg for tegn på kontaminering.

3. Subretinale organoider implantation

  1. Udfør en 0,5-1 cm lateral canthotomi med Stevens tenotomi saks. Placer et Barraquer øjenlågsspekulum i passende størrelse for at holde øjenlågene åbne. Sørg for, at den kirurgiske assistent skyller hornhinden regelmæssigt med BSS under procedurens varighed.
  2. Placer 2 opholdssuturer på 6-0 silkesutur i bindehinden umiddelbart ved siden af limbussen ved 4 og 8 o'clock positioner for at holde øjet i primært blik og trække det tredje øjenlåg tilbage. Brug 0,5 Castroviejo hornhindebindingspincet og en lille myggehemestat til forsigtigt at tage fat i bulbar conjunctiva ved siden af limbussen. Lad suturerne være lange og klem enderne med små myghæmostater for at hjælpe med deres manipulation.
    BEMÆRK: Det er vanskeligere at placere suturen under det tredje øjenlåg; Sørg for at placere det umiddelbart ved siden af limbussen.
  3. Placer en anden sutur klokken 12 ved limbussen delvist gennem tykkelsen af limbussen, pas på ikke at trænge ind i øjet. Knude denne sutur løst og skær enderne korte. Dette giver en robust ankersutur, som bruges under operationen som et "håndtag" til at rotere øjet for at give kirurgen adgang til forskellige dele af kloden i forskellige stadier af proceduren.
    BEMÆRK: Trin 3.2 og 3.3 kan inverteres. Sekvensen af ophold suturer placering er kirurgens præference.
  4. Reflekter bulbar conjunctiva mellem klokken 10-2 (en perimetri). Brug tenotomi saks til at skære bindehinden 2-3 mm fra limbussen. Underminere det og ryd tenons kapsel for at udsætte sclera på stederne for klokken 2 og 10 vitrektomiporte, som vil blive placeret ca. 3-5 mm fra limbusen afhængigt af dyrets alder. Brug kirurgiske cellulosespyd til hæmostase og til at rydde blod.
  5. Identificer steder for sklerotomi efter refleksion af bindehinden og tenons kapsel ved hjælp af kalibre. Vælg sklerotomisteder (klokken 2 og 10 med det formål at passere gennem pars plana) for at undgå de store scleralfartøjer, der kan være fremtrædende hos katten. Brug vådfeltkauteri på sclera på de planlagte sclerotomisteder for at reducere scleral blødning, planlægning af et ~ 3 mm område ved instrumentporten (klokken 10 for en højrehåndet kirurg), da dette vil blive forstørret efter vitrektomien for at tillade implantationskanylen at blive introduceret.
  6. Forplacerede korsmønstersuturer (6-0 eller 7-0 polyglactinsutur) uden at binde knuden på stedet for de foreslåede sclerotomier, før vitrektomiportene placeres.
    BEMÆRK: Dette letter hurtig lukning af sclerotomierne ved afslutningen af proceduren. Suturen til den planlagte instrumentport skal have en længere bid sclera, da dette vil være et langt snit.
  7. Når suturerne er placeret, skal du bede assistenten om at hjælpe med at placere kloden ved at holde 12-tiden opholdssuturer ved at binde eller bruge biskop-Harmon-tang. Lad kirurgen også stabilisere kloden ved hjælp af en 0,12 mm Castroviejo-tang til at holde vævet ved siden af sklerotomistedet.
    1. Indfør en 23 G vitrektomiport ved hjælp af en trocar gennem sclera både klokken 2 og 10 positioner rettet i en vinkel mod synsnerven for at undgå at komme i kontakt med linsen.
    2. Kontroller, at vandingsporten er i glaslegemet ved forsigtigt at skubbe på porten ved hjælp af bindingstang, så spidsen kan visualiseres i glaslegemet. Når den korrekte placering er bekræftet, skal du fastgøre vandingsledningen til porten og placere linjen ved hjælp af tynde klæbende bandager for at tape den på plads. Indstil vitrektomiinfusionen af BSS-bufferen indledningsvis til 30-35 mmHg ved at trykke på pileknapperne (opad eller nedad), der findes på glastomimaskinens frontpanel.
  8. Lad assistenten holde en Machemer-forstørrelsesforstørrelsesvandingsglaslinse på hornhinden for at muliggøre visualisering af det bageste segment af øjet i de næste faser. Fastgør den irrigaterende vitrektomilinse til et drypsæt, der giver konstant væsketilførsel for at koble linsen til hornhinden.
    BEMÆRK: Andre former for kontaktvitrektomilinse kan også bruges. Dæmp eller sluk rumlyset for at hjælpe visualisering gennem operationsmikroskopet.
  9. Indsæt 23 G vitrektomisonden / cutteren (2.500 cpm) gennem instrumentporten (ved siden af kirurgens dominerende hånd, dvs. kl. 10-porten til en højrehåndet kirurg) og udfør en delvis kernevitrektomi.
    1. Fjern derefter glaslegemet helt fra retinaloverfladen i det område, der vil modtage transplantationen (dette er vigtigt for procedurens succes) ved at løsne glaslegemet fra nethinden.
    2. Placer vitrektomisonden over synsnervehovedet med porten vendt væk fra nethinden, og påfør højere vakuum for at starte glaslegemets ansigtsløsrivelse.
  10. Forbered triamcinolonkrystaller til intraokulær brug. Hvis triamcinolonsuspensionen ikke er specifikt til intravitreal brug, vaskes krystallerne og suspenderes derefter igen i BSS.
    1. Indledningsvis filtreres suspensionen ved hjælp af et sterilt 0,22 μm poresprøjtefilter med PES-membran (fastgjort til en 1 ml sprøjte) for at fange krystallerne.
    2. Vask derefter de fangede triamcinolonkrystaller ved at aspirere BSS i 1 ml sprøjten og skylle gennem filteret (krystallerne forbliver fanget i filteret). Dette fjerner konserveringsmidlerne i opløsningen. Gentag vasken 3 gange, hvorefter krystallerne opslæmmes igen i 1 ml BSS.
  11. Indfør nålen på sprøjten, der holder triamcinolon, gennem instrumentporten. Pas på ikke at røre objektivet ved at se spidsen af nålen gennem pupillen, mens nålen føres gennem instrumentporten. Injicer 0,25 til 0,5 ml krystalsuspension. Indsæt derefter vitrektomisonden gennem instrumentporten, og før den tæt på synsnervehovedet med porten væk fra nethinden, og brug højt vakuum til at løsne glaslegemet fra nethinden.
    BEMÆRK: Triamcinolonkrystallerne klæber til og fremhæver dermed de resterende glaslegemer. Fjern forsigtigt alt glaslegeme over og ved siden af stedet for planlagt organoidimplantation (f.eks. den centrale tapetale fundus tæt på området centralis-regionen ).
  12. Opret en lille fokal nethindeløsning bleb på det ønskede implantationssted ved hjælp af en subretinal injektor, fx 23 G subretinal injektor med en udtrækkelig 41 G kanyle fastgjort til en steril 250 μL gastæt Luer lock sprøjte fyldt med steril BSS.
    1. Før du opretter den subretinale bleb, reduceres infusionstrykket til 10 mmHg for at lette blæsedannelsen.
    2. Indsæt injektoren gennem instrumentporten, og før den mod nethinden. Ekstruder kanylespidsen og tryk den forsigtigt på retinaloverfladen. Bed assistenten om at give et let hurtigt tryk på sprøjtestemplet for at starte nethindeløsningen, der reducerer injektionstrykket for at muliggøre en langsom forøgelse af nethindeløsningen, indtil den ønskede størrelse er opnået (ca. 100 til 200 μL BSS anvendes).
  13. Hvis den oprettede retinotomi er i en passende position, som undgår at skære nethinden mellem implantationsstedet og synsnervehovedet for at forhindre sektionering af nervefiberlaget afledt af implantationsstedet og for at undgå større retinale blodkar (dette bestemmes også af undersøgelsesdesignet, i vores tilfælde blev den centrale nethinden valgt), Forstør det derefter lidt ved hjælp af injektorens 41 G-kanyle med det formål at lette indførelsen af retinal saks.
  14. Fjern injektoren fra øjet, og fjern klearralporten klokken 10. Forstør sklerotomien på dette sted ved hjælp af en lige 2,85 mm spaltekniv / keratom orienteret mod synsnerven for at undgå at røre linsen. Oprethold infusionstrykket ved 10-15 mmHg.
  15. Udvid retinotomien ved hjælp af vitreoretinal lodret 80 ° saks med klemmehåndtag, undgå at skære retinale kar for at forhindre retinal blødning, og sørg for at skære nethinden ved kanten af bleb væk fra synsnervehovedet for at undgå at skære nervefibre, der fører fra nethinden i transplantationsområdet til synsnerven. Retinotomien skal være af tilstrækkelig bredde til at modtage organoiderne.
  16. Indsæt den forudindlæste glaskapillær indeholdende organoiderne (se trin 2.10) gennem den forstørrede sklerotomi og før den mod retinotomistedet under direkte visualisering.
    1. Brug spidsen af glaskapillæret til let at åbne retinotomien for at få adgang til åbningen i den subretinale bleb.
    2. Bed assistenten om langsomt at trykke på injektorens stempel, mens du ser gennem mikroskopet og injicerer organoiderne i subretinal bleb. BSS bør gå forud for organoiderne og skylle retinotomien åben.
    3. Skub forsigtigt organoiderne inden i bleben med spidsen af glaskapillæret, hvis de er ved kanten af retinotomien.
  17. Hold glaskapillæret ved retinotomien i et par sekunder for at forsøge at lukke retinotomien og forhindre organoiderne i at slippe ud i glaslegemet.
  18. Fjern meget langsomt glaskapillæret fra øjet og undgå pludselig frigivelse af væske fra øjet for at undgå væskebevægelse i øjet, der kan udvise organoiderne fra subretinal bleb.
  19. Langsomt øge infusionstrykket til 20-30 mmHg for at forhindre intraokulær blødning, og pas på, at infusionsvæsken ikke vasker direkte på bleben. Dette udføres ved at trykke på de opadgående pileknapper, der findes på frontpanelet på vitrektomimaskinen.
  20. Luk sklerotomien ved hjælp af den forudplacerede sutur i et korsmønster (6-0 eller 7-0 polyglactin). Tilføj yderligere enkle afbrudte suturer efter behov for at forsegle sklerotomien.
  21. Bed assistenten om at fjerne infusionsporten, og lad kirurgen hurtigt binde den forudplacerede sutur for at forsegle sklerotomien og forhindre tab af intraokulært tryk.
  22. Luk konjunktivalsnittet (peritomi) ved hjælp af 6-0 eller 7-0 polyglactin i et simpelt kontinuerligt mønster.
  23. Tag et billede af fundusen (f.eks. ved hjælp af et RetCam II videofunduskamera, Clarity eller lignende), og optag organoidernes umiddelbare position i det subretinale rum.
  24. Forbered den okulære overflade igen efter billeddannelse ved hjælp af 0,2% povidon jodopløsning ved hjælp af bomuldsspidsapplikatorer og bomuldskugler. Fjern de tre opholdssuturer og lågspekulumet.
  25. Luk den laterale katotomi med 6-0 polyglactin sutur. Placer en enkelt begravet sutur efterfulgt af en figur på 8 hudsuturer for at reformere den laterale canthus og brug derefter enkle afbrudte hudsuturer til at lukke resten af såret.
  26. Når den kirurgiske procedure er afsluttet, gives en subkonjunktival injektion af en steroid- og antibiotikakombination (2 mg methylprednisolonacetat, 0,1 mg dexamethason og 1 mg gentamicin). Placer et oftalmisk smøremiddel (kunstige tårer) på hornhinden.
  27. Gendan dyret fra anæstesi og overvåg nøje under genopretning for tegn på smerte, der ville kræve yderligere behandling, såsom markant blefarospasme, alvorlig modvilje mod at blive manipuleret, sløvhed eller nedsat appetit og øget åndedræts- og hjertefrekvens. Giv postoperativ analgesi efter behov og overvåg nøje for ubehag.
    BEMÆRK: Kun korrekt uddannet personale bør være ansvarlig for bedøvelse og overvågning af kattepatienterne før, under og efter operationen. Følg den lokale dyreetiske komités anbefalinger for postoperativ pleje.

4. Procedurer efter implantation, postoperativ behandling og vurdering

  1. Fortsæt med at behandle med oral immunsuppressiv medicin (1 mg / kg prednisolon og 2 mg / kg cyclosporin oralt to gange om dagen) for at hjælpe med at kontrollere inflammation og afvisning af organoiderne. Giv systemisk antibiotikadækning (f.eks. oral doxycyclin 5 mg/kg to gange dagligt – dette antibiotikum blev valgt på grund af risikoen for opportunistisk mycoplasmal infektion hos immunsupprimerede dyr).
  2. Udfør regelmæssige oftalmiske undersøgelser for at overvåge for betændelse eller udvikling af bivirkninger. Overvåg retinal bleb for udfladning, som opstår i løbet af de første par dage efter operationen på trods af den store retinotomi, der kræves for organoider, der skal injiceres i det subretinale rum. Optag fundusbilleder ved hver undersøgelse for at registrere placeringen og udseendet af de transplanterede organoider.
  3. Tag billeder af dyrene under generel anæstesi ved konfokal scanning, laseroftalmoskopi (cSLO) og spektraldomæne – optisk kohærenstomografi (SD-OCT)5,31 i overvågningsperioden og før forsøgets afslutning.
  4. Aflive dyrene humant ved forsøgets afslutning ved hjælp af en AVMA-godkendt metode, f.eks. intravenøs administration af 85 mg/kg pentobarbital. Efter sedation skal du placere et intravenøst kateter til administration af pentobarbital for at minimere stress. Bekræft døden ved ophør af hjerteslag og lav et snit i thoraxen for at skabe en pneumothorax.
  5. Fjern øjnene via en standard transkonjunktival tilgang og fix efter behov. Til immunhistokemi (IHC) nedsænkes øjnene straks i 4% paraformaldehydopløsning, efter at 0,3 ml af fikseringsopløsningen injiceres i det bageste segment gennem 3 slidser fremstillet gennem pars plana med et 11 Parker blad (~ 3-4 mm fra limbus).
  6. Disseker øjenkopperne efter 3,5 timers fiksering ved 4 °C. Fjern resterende glaslegeme, og sørg for at bevare nethinden og organoiderne intakte. Sæt det tilbage i fikseringsmiddel i yderligere 30 minutter ved 4 °C, skyl derefter øjenkopperne 3 gange hver i 10 minutter i PBS. Øjenkoppen overføres til 15% saccharose i 2 timer og derefter til 30% saccharose i yderligere 2 timer.
  7. Øjenkoppen skylles to gange med PBS og indlejres i OCT-medium (optimal skæretemperaturforbindelse) og lynfryses, derefter opbevares ved -80 °C indtil sektionering til histologi og immunkemi.
  8. Vælg antistoffer mod IHC baseret på undersøgelsesprotokollen og målene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne procedure muliggør vellykket og reproducerbar implantation af hPSC-afledte retinale organoider i det subretinale rum i en dyremodel med store øjne (demonstreret her ved hjælp af 2 eksempler: vildtypekatte med sunde fotoreceptorer (PR'er) og CrxRdy/+ katte med degenererende PR'er og nethinden). Ved hjælp af trinene angivet i figur 1 fremstilles og lægges de hPSC-afledte retinale organoider i injektionsanordningens borosilikatglaskanyle, således at organoiderne ikke beskadiges. Dette kan bekræftes ved direkte visualisering under belastningen af organoiderne (trin 2.10) og under operationen (trin 3.16) (figur 2A, B) samt ved fundusbilleddannelse ved afslutningen af operationen (trin 3.23, figur 2C). Tilstedeværelsen af organoiderne i det subretinale rum ved hjælp af denne teknik bekræftes postoperativt ved oftalmisk undersøgelse og fundusbilleddannelse (figur 3A), som registrerer organoidernes position og udseende. At kende transplantationens position er meget vigtig, når man behandler kloderne til frossen histologi og immunhistokemi og reducerer arbejdsbyrden væsentligt, da det tager tid at skære et stort øje ved 12-14 μm (tykkelse af en kryosektion). Før eutanasi udføres også konfokal scanning laser oftalmoskopi (cSLO) og spektral domæne - optisk kohærenstomografi (SD-OCT) billeddannelse for at vurdere organoidernes position i det subretinale rum (figur 3A-D). Disse teknikker demonstrerer persistensen af retinale organoider i det subretinale rum (mellem den neurale nethinden og RPE) i modtagerøjet (figur 3E). Efter eutanasi (udført humant efter AVMA-anbefalinger) udføres histologi og immunhistokemi (IHC) rutinemæssigt (se detaljer i tidligere offentliggjort papir31). Histologien og IHC viser overlevelsen af xenogene transplantater (hPSC-afledte retinale organoider) i det subretinale rum i et stort øje, når dyrene var immunsupprimerede (som tidligere beskrevet31), se figur 4.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over trinnene til forberedelse af organoider før implantationen.
Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kirurgiske subretinale implantationer af organoider. (A) Direkte visualisering af organoider, der leveres ind i det subretinale rum gennem en glaskanyle uden at blive beskadiget, (B) Direkte visualisering af organoider i subretinal bleb, (C) Vidvinkel fundusfarvebillede af de subretinalt implanterede organoider umiddelbart efter operationen. De blæste kanter er angivet med de sorte pilespidser og retinotomistedet med de sorte stjerner.
Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Postoperativ vurdering af subretinalt implanterede organoider 3 måneder efter implantation i en CrxRdy/+ kat. (A) Fundusfarvebillede af de subretinalt implanterede organoider, (B) cSLO fundusbillede af de subretinalt implanterede organoider, (C) 3D-volumenscanningsrekonstruktion af det område, der indeholder organoiderne, (D) cSLO-billede af det område, der indeholder subretinale organoider, (E) SD-OCT-tværsnitsbillede i høj opløsning af de subretinalt implanterede organoider. Retinotomistedet er angivet med de sorte stjerner.
Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Human retinal organoid-afledte fotoreceptorark (PR-markør RCVRN) i subretinale rum af CrxRdy/+ kat, 3 måneder efter podning.  *Synaptiske boutoner (hSYP=Synaptophysin) i kattens indre kernelag (INL).
Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Implantation af hPSC-afledt nethindevæv (retinale organoider) i det subretinale rum er en lovende eksperimentel tilgang til at genoprette synet for senstadiet retinale degenerative sygdomme forårsaget af PR-celledød (dyb eller terminal blindhed). Den præsenterede tilgang bygger på en tidligere udviklet og vellykket testet eksperimentel terapi baseret på subretinal podning af et stykke humant føtalt nethindevæv23,24,25. Det præsenterer brugen af en alternativ, genopfyldelig og etisk acceptabel retinal vævskilde afledt af hPSC'er. Demonstration af kirurgisk gennemførlighed og okulær sikkerhed ved terapi i store øjendyremodeller51,55 er nødvendig for at fremme denne lovende tilgang til kliniske anvendelser. Dette manuskript giver en detaljeret metode til subretinal implantation af hPSC-3D retinal væv (retinale organoider) i en stor dyremodel med både normal og degenererende nethinde (model af CrxRdy/+ katte model af LCA). Selvom procedurer for indførelse af et fladt stykke menneskelig nethinden og også RPE-patches er blevet udviklet43,44,45, er transplantation af større 3D-transplantater (nødvendige for at genoprette synet under forhold med avanceret RD) ikke blevet undersøgt. Protokollen beskrevet her i detaljer er for en transplantationsprocedure til subretinal levering af hele retinale organoider (snarere end organoide fælge33,41), der også bærer noget RPE som en potentielt bedre måde at introducere intakte retinale ark med PR'er for at øge transplantatoverlevelsen og forbedre arkbevarelsen. Bemærk, at forskellige dele af denne protokol er veletablerede. For eksempel er vitrektomi meget udbredt af vitreoretinale kirurger under retinal reattachment kirurgi 56,57,58,59,60. Subretinale injektioner bliver mere almindeligt anvendt, for eksempel i genforstørrelsesterapi 3,7,61,62,63,64. Der er begrænsede beskrivelser af skabelsen af en passende retinotomi og injektionen af relativt store organoider i det subretinale rum.

De kritiske trin omfatter omhyggelig positionering og udførelse af sklerotomi for at undgå linsen, fuldstændig fjernelse af glaslegemet cortex fra retinal overflade over transplantationsstedet, kontrolleret dannelse af subretinal bleb, generering af retinotomi af den optimale størrelse for at imødekomme bredden af transplantationskanulen, opretholdelse af det definerede infusionstryk under forskellige trin, og kanyle tilbagetrækning. Valg af den rigtige transplantationskanyle med optimeret indre og ydre diameter (ID og OD) og længde, kontrol af intraokulær blødning, sterilitet af hele proceduren fra organoider til kirurgisk rum og instrumenter og operationens varighed (30-45 min / dyr) for at sikre optimale resultater. Forfatterne finder, at de bedste resultater opnås med 23 G vitrektomi på grund af tykkelsen / viskositeten af katteglaslegemet, hvilket skaber en bleb med en injektor med en 41 G kanyle og derefter udvider retinotomien ved kanten af bleben ved hjælp af 80 ° vinkel retinal saks. Andre vigtige faktorer omfatter udvidelse af sklerotomien ved hjælp af et 2,85 mm keratom til at passe til borosilikatglaskanylen (ydre diameter OD 1,52 mm; indvendig diameter, ID 1,12 mm; og længde 10,16 cm) og tillader implantation af større organoider i et stort øje med aksial længde ca. 20,5 mm (20,91 mm ± 0,53 mm)55. Brugen af en glaskapillær var den nuværende bedste tilgængelige til lastning og levering af nedstigningsstørrelsesorganoider uden at beskadige dem under implantationsprocessen. Det blev konstateret, at reduktion af infusionstrykket fra 20-30 mmHg under vitrektomi til 10 mmHg under blebdannelsestrinnet er optimalt til generering af retinale løsrivelser, der er nødvendige for at skabe plads til retinale organoider. Derudover er levedygtigheden af hPSC-3D retinal væv (organoider) under langdistanceforsendelse og valg af det optimerede immunsuppressionsregime til vedligeholdelse af xenogene humane transplantater kritisk, som for nylig rapporteret31,54.

Forfatterne fandt, at på grund af den stærkt reflekterende kat tapetum endo-belysning var ikke nødvendig for at udføre operationen. Transplantation i en atapetal art (fx svin, ikke-menneskelig primat) ville kræve en 3-port vitrektomi, der omfatter endo-belysning. Tamponade (f.eks. med perfluorcarbon efterfulgt af silikoneolie) som udført i rutinemæssig nethindeløsning kirurgi blev ikke udført, fordi tryk på bleb ville risikere at ekstrudere organoiderne i glaslegemet. Den fremtidige udvikling kan omfatte brugen af materialer, der i øjeblikket undersøges til forsegling af nethindehuller. Dette kan bruges til at forhindre ethvert tab af organoider i glaslegemet efter implantation. Derudover kan Triescence, som ligner Kenalog-40, men indeholder konserveringsmiddelfri triamcinolon, bruges som et alternativ til at visualisere glaslegemet.

Den mindre klodestørrelse hos yngre dyr (f.eks. 1-2 måneder) gav flere kirurgiske udfordringer sammenlignet med det store øje (voksne dyr). Ikke desto mindre er det ved hjælp af metoden beskrevet her muligt at levere subretinale transplantater. I CrxRdy/+ LCA-modellen viste det sig, at større retinale blebs ikke altid blev fastgjort igen. At holde bleb til den mindste størrelse, der er nødvendig for at tillade retinale organoider, der skal injiceres, reducerede denne komplikation. Transplantation tidligere i RD nethinden (før det fuldstændige tab af PR'er, når neurale nethinden bliver markant tyndere) er en anden retningslinje i tråd med det tidligere arbejde med humane føtale nethindetransplantater20. En anden note – den detaljerede teknik afhænger ikke af at placere retinalarket i korrekt retning, fordi hele retinale organoider transplanteres. Med udvikling af flade hESC-retinale ark vil dette være vigtigt. Det er dog ikke fokus for denne protokol, der sigter mod at levere intakte hESC-retinale vævsplader og optimere subretinal bevarelse af PR-ark. Når teknikken var udviklet, var den reproducerbar i både normal og RD nethinden.

Der er mange potentielle komplikationer til denne kirurgiske procedure. Kun dem, der er uddannet i vitreoretinal kirurgi (f.eks. uddannede veterinære øjenlæger eller vitreoretinale kirurger, der er bekendt med artsforskellene i katteøjet sammenlignet med det menneskelige øje) bør foretage proceduren. Mulige komplikationer omfatter linseberøring under trocar placering, scleral blødning under sklerotomi udvidelsen, og subretinale eller retinale blødninger. Andre komplikationer såsom værtens immunrespons på xenogene humane organoidtransplantater, der fører til ødelæggelse af transplantatet over tid eller endophthalmitis er mulige; Brug af orale immunsuppressive og antibiotiske lægemidler hjælper med at forhindre disse i at forekomme. Det er også vigtigt at bemærke, at der er forskel på implantation i vildtype og CrxRdy/+ katte. Når der er fremskreden retinal degeneration, har retinal bleb tendens til at sprede sig bredere end i vildtypen, og i nogle tilfælde kan dette forhindre fuldstændig retinal reattachment efter operationen. Den teknik, der præsenteres her, kan anvendes til implantation af organoider i øjnene af store dyremodeller af IRD'er. Yderligere forfining vil være nødvendig, når transplantationen er klar til oversættelse til klinikken.

Baseret på forfatternes erfaring med at udføre komplekse vitreoretinale kirurgiske procedurer i store øjenmodeller, bør teknikken præsenteret i dette manuskript være anvendelig på andre store dyremodeller (med inkludering af endobelysning i atapetale arter), der anvendes til oversættelse af vitreoretinale kirurgiske teknikker til klinikken43,44,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ratnesh K. Singh, Ph.D., Francois Binette, Ph.D., og Igor O. Nasonkin Ph.D. er ansatte i Lineage Cell Therapeutics, Inc. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af NEI Fast-track SBIR grant R44-EY027654-01A1 og SBIR grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones er co-PI). Forfatterne vil gerne takke fru Janice Querubin (MSU RATTS) for hendes hjælp med anæstesi og generel pleje af dyrene, der er inkluderet i denne undersøgelse, samt hjælp til kirurgisk indstilling og instrumenter, forberedelse / sterilisering. Forfatterne vil gerne takke Dr. Paige Winkler for hjælpen med at modtage organoiderne og placere dem i medierne dagen før implantationen og for hjælpen på implantationsdagen. Forfatterne er også taknemmelige for Mr. Randy Garchar (LCTX) for flittig forsendelse af retinale organoider, samling af afsenderen og download af temperatur og G-stress-records efter hver forsendelse. Dette arbejde blev udført, mens forfatteren Igor Nasonkin var ansat af Biotime (nu Lineage).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore syringe filter with PES membrane Cameo NA can be found through various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula DORC 1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe Hamilton NA can be found through various suppliers
6-0 Silk suture Ethicon 707G
6-0/7-0 polyglactin suture Ethicon J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) Henry Schein Animal Health NA can be found through various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL Par Pharmaceutical NA can be found through various suppliers
cSLO + SD-OCT Heidelberg Engineering Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine Novartis NA can be found through various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium) Vetone NA can be found through various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL Cipla NA can be found through various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarbital solution) Vortech NA can be found through various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL Hospira NA can be found through various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing World Precision Instruments TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL Pfizer NA can be found through various suppliers
Microscope Zeiss NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) Sakura 4583
Olympic Vac-Pac Size 23 Natus NA can be found through various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution EMS 15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution Akorn NA can be found through various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL Akorn NA can be found through various suppliers
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) Zoetis NA can be found through various suppliers
RetCam II video fundus camera Clarity Medical Systems NA can be found through various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) Bristol -Myers Squibb Company NA can be found through various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution Akorn NA can be found through various suppliers
Vitrectomy 23G port Alcon Accurus systems
Vitrectomy machine Alcon Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle Frimen FT170206T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veleri, S., et al. Biology and therapy of inherited retinal degenerative disease: insights from mouse models. Disease Models and Mechanisms. 8 (2), 109-129 (2015).
  2. Dias, M. F., et al. Molecular genetics and emerging therapies for retinitis pigmentosa: Basic research and clinical perspectives. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 107-131 (2018).
  3. Petersen-Jones, S. M., et al. Patients and animal models of CNGbeta1-deficient retinitis pigmentosa support gene augmentation approach. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 190-206 (2018).
  4. Winkler, P. A., et al. A large animal model for CNGB1 autosomal recessive retinitis pigmentosa. PLoS One. 8 (8), 72229 (2013).
  5. Occelli, L. M., Tran, N. M., Narfstrom, K., Chen, S., Petersen-Jones, S. M. CrxRdy Cat: A large animal model for CRX-associated leber congenital amaurosis. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (8), 3780-3792 (2016).
  6. Mowat, F. M., et al. Early-onset progressive degeneration of the area centralis in RPE65-deficient dogs. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (7), 3268-3277 (2017).
  7. Occelli, L. M., et al. Gene supplementation rescues rod function and preserves photoreceptor and retinal morphology in dogs, leading the way towards treating human PDE6A-retinitis pigmentosa. Human Gene Therapy. 28 (12), 1189-1201 (2017).
  8. Eckhorn, R., et al. Visual resolution with retinal implants estimated from recordings in cat visual cortex. Vision Research. 46 (17), 2675-2690 (2006).
  9. Pardue, M. T., et al. Status of the feline retina 5 years after subretinal implantation. Journal of Rehabilitation Research and Development. 43 (6), 723-732 (2006).
  10. Chow, A. Y., et al. Subretinal implantation of semiconductor-based photodiodes: durability of novel implant designs. Journal of Rehabilitation Research and Development. 39 (3), 313-321 (2002).
  11. Volker, M., et al. In vivo assessment of subretinally implanted microphotodiode arrays in cats by optical coherence tomography and fluorescein angiography. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 242 (9), 792-799 (2004).
  12. Chow, A. Y., et al. Implantation of silicon chip microphotodiode arrays into the cat subretinal space. Institute of Electrical and Electronics Engineering Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 9 (1), 86-95 (2001).
  13. Sachs, H. G., et al. Subretinal implantation and testing of polyimide film electrodes in cats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 464-468 (2005).
  14. Villalobos, J., et al. A wide-field suprachoroidal retinal prosthesis is stable and well tolerated following chronic implantation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (5), 3751-3762 (2013).
  15. Bragadottir, R., Narfstrom, K. Lens sparing pars plana vitrectomy and retinal transplantation in cats. Veterinary Ophthalmology. 6 (2), 135-139 (2003).
  16. Narfstrom, K., Holland Deckman, K., Menotti-Raymond, M. The domestic cat as a large animal model for characterization of disease and therapeutic intervention in hereditary retinal blindness. Journal of Ophthalmology. , 906943 (2011).
  17. Seiler, M. J., et al. Functional and structural assessment of retinal sheet allograft transplantation in feline hereditary retinal degeneration. Veterinary Ophthalmology. 12 (3), 158-169 (2009).
  18. Aramant, R. B., Seiler, M. J. Transplanted sheets of human retina and retinal pigment epithelium develop normally in nude rats. Experimental Eye Research. 75 (2), 115-125 (2002).
  19. Lin, B., McLelland, B. T., Mathur, A., Aramant, R. B., Seiler, M. J. Sheets of human retinal progenitor transplants improve vision in rats with severe retinal degeneration. Experimental Eye Research. 174, 13-28 (2018).
  20. Seiler, M. J., Aramant, R. B. Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (6), 661-687 (2012).
  21. Seiler, M. J., et al. Vision recovery and connectivity by fetal retinal sheet transplantation in an immunodeficient retinal degenerate rat model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (1), 614-630 (2017).
  22. Lorach, H., et al. Transplantation of mature photoreceptors in rodents with retinal degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 30 (2019).
  23. Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
  24. Radtke, N. D., Aramant, R. B., Seiler, M. J., Petry, H. M., Pidwell, D. Vision change after sheet transplant of fetal retina with retinal pigment epithelium to a patient with retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 122 (8), 1159-1165 (2004).
  25. Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
  26. Lorach, H., Palanker, E. Retinal prostheses: High-resolution photovoltaic implants. Medical Science (Paris). 31 (10), 830-831 (2015).
  27. Mathieson, K., et al. Photovoltaic retinal prosthesis with high pixel density. Nature Photonics. 6 (6), 391-397 (2012).
  28. Banin, E., et al. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24 (2), 246-257 (2006).
  29. Hambright, D., et al. Long-term survival and differentiation of retinal neurons derived from human embryonic stem cell lines in un-immunosuppressed mouse retina. Molecular Vision. 18, 920-936 (2012).
  30. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  31. Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells and Development. 28 (17), 1151-1166 (2019).
  32. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  33. Assawachananont, J., et al. Transplantation of embryonic and induced pluripotent stem cell-derived 3D retinal sheets into retinal degenerative mice. Stem Cell Reports. 2 (5), 662-674 (2014).
  34. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  35. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  36. Singh, R. K., et al. Characterization of three-dimensional retinal tissue derived from human embryonic stem cells in adherent monolayer cultures. Stem Cells and Development. 24 (23), 2778-2795 (2015).
  37. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  38. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  39. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  40. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  41. Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 81-90 (2016).
  42. Mandai, M., et al. iPSC-derived retina transplants improve vision in rd1 end-stage retinal-degeneration mice. Stem Cell Reports. 8 (4), 1112-1113 (2017).
  43. Scruggs, B. A., et al. Optimizing donor cellular dissociation and subretinal injection parameters for stem cell-based treatments. Stem Cells Translational Medicine. 8 (8), 797-809 (2019).
  44. Singh, R., et al. Pluripotent stem cells for retinal tissue engineering: Current status and future prospects. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (4), 463-483 (2018).
  45. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11, 475 (2019).
  46. Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (6), 835-846 (2007).
  47. Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (8), 1553-1565 (2016).
  48. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  49. Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
  50. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a Phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  51. Petersen-Jones, S. M., Komaromy, A. M. Dog models for blinding inherited retinal dystrophies. Human Gene Therapy. Clinical Development. 26 (1), 15-26 (2015).
  52. Beltran, W. A., et al. Canine retina has a primate fovea-like bouquet of cone photoreceptors which is affected by inherited macular degenerations. PLoS One. 9 (3), 90390 (2014).
  53. Nasonkin, I. O., et al. Transplantation of human embryonic stem cell derived retinal tissue in the subretinal space of immunodeficient rats with retinal degeneration (RD). Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (9), 3109 (2019).
  54. Singh, R. K., et al. Development of a protocol for maintaining viability while shipping organoid-derived retinal tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (2), 388-394 (2020).
  55. Petersen-Jones, S. M. Drug and gene therapy of hereditary retinal disease in dog and cat models. Drug Discovery Today. Disease Models. 10 (4), 215-223 (2013).
  56. Machemer, R., Buettner, H., Norton, E., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1972).
  57. Machemer, R., Norton, E. W. Vitrectomy, a pars plana approach. II. Clinical experience. Modern Problems in Ophthalmology. 10, 178-185 (1972).
  58. Machemer, R., Parel, J., Norton, E. Vitrectomy: a pars plana approach. Technical improvements and further results. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 76 (2), 462-466 (1972).
  59. O'Malley, C., Heintz, R. M. Vitrectomy with an alternative instrument system. Annals of Ophthalmology. 7 (4), 585-588 (1975).
  60. Machemer, R., Hickingbotham, D. The three-port microcannular system for closed vitrectomy. American Journal of Ophthalmology. 100 (4), 590-592 (1985).
  61. Petersen-Jones, S. M., et al. AAV retinal transduction in a large animal model species: comparison of a self-complementary AAV2/5 with a single-stranded AAV2/5 vector. Molecular Vision. 15, 1835-1842 (2009).
  62. Annear, M. J., et al. Successful gene therapy in older Rpe65-deficient dogs following subretinal injection of an adeno-associated vector expressing RPE65. Human Gene Therapy. 24 (10), 883-893 (2013).
  63. Beltran, W. A., et al. Optimization of retinal gene therapy for X-linked retinitis pigmentosa due to RPGR mutations. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1866-1880 (2017).
  64. Bainbridge, J. W. B., et al. Long-term effect of gene therapy on Leber's Congenital Amaurosis. The New England Journal of Medicine. 372 (20), 1887-1897 (2015).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 174 retinale organoider kat store øjne dyr model subretinal transplantation retinal degeneration kirurgisk teknik
Subretinal transplantation af humant embryonalt stamcelleafledt nethindevæv i en kattemodel med store dyr
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh,… More

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh, R. K., Binette, F., Nasonkin, I. O., Petersen-Jones, S. M. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model. J. Vis. Exp. (174), e61683, doi:10.3791/61683 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter