क्रिस्टलोग्राफी द्वारा बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स के संरचनात्मक अध्ययनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल की आवश्यकता होती है। यहां हम एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं जिसका उपयोग ऑप्टिक्रिस्ट (हमारी प्रयोगशाला में विकसित एक पूरी तरह से स्वचालित उपकरण) और क्रिस्टलीकरण चरण आरेख के ज्ञान के आधार पर बड़े उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल उगाने के लिए माइक्रोडायलिसिस बटन द्वारा किया जा सकता है।
न्यूट्रॉन मैक्रोमॉलिक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी (एनएमएक्स) का उपयोग तेजी से विस्तार कर रहा है, जो पिछले दशक में निर्धारित अधिकांश संरचनाओं के साथ नए एनएमएक्स बीमलाइनों का निर्माण किया गया है और संरचना शोधन सॉफ्टवेयर की उपलब्धता में वृद्धि हुई है। हालांकि, एनएमएक्स के लिए वर्तमान में उपलब्ध न्यूट्रॉन स्रोत एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए समकक्ष स्रोतों की तुलना में काफी कमजोर हैं। इस क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, न्यूट्रॉन विवर्तन अध्ययनों के लिए हमेशा बड़े क्रिस्टल की आवश्यकता होगी, विशेष रूप से कभी-बड़े मैक्रोमॉलिक्यूल्स और परिसरों का अध्ययन करने की प्रवृत्ति के साथ। इसलिए एनएमएक्स के विस्तार के लिए बड़े क्रिस्टल उगाने के लिए अनुकूल तरीकों और इंस्ट्रूमेंटेशन में और सुधार आवश्यक हैं।
इस काम में, हम अपनी प्रयोगशाला में विकसित तर्कसंगत रणनीतियों और एक क्रिस्टल ग्रोथ बेंच (ऑप्टीक्रिस्ट) का परिचय देते हैं जो क्रिस्टलीकरण समाधानों (जैसे, तेज़ एकाग्रता, पीएच, योजक, तापमान) के सटीक स्वचालित नियंत्रण के साथ माइक्रोस्कोप-माउंटेड वीडियो कैमरे के माध्यम से वास्तविक समय अवलोकन को जोड़ती है। फिर हम प्रदर्शित करते हैं कि तापमान और रासायनिक संरचना का यह नियंत्रण मॉडल घुलनशील प्रोटीन का उपयोग करके इष्टतम क्रिस्टलीकरण स्थितियों की खोज की सुविधा कैसे प्रदान करता है। क्रिस्टलीकरण चरण आरेख का संपूर्ण ज्ञान किसी भी क्रिस्टलीकरण प्रयोग के लिए शुरुआती स्थिति और गतिज पथ का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम दिखाते हैं कि कैसे एक तर्कसंगत दृष्टिकोण बहुआयामी चरण आरेखों के ज्ञान के आधार पर उत्पन्न क्रिस्टल के आकार और संख्या को नियंत्रित कर सकता है।
प्रोटीन के संरचना-कार्य संबंधों और शारीरिक रास्तों के तंत्र को समझना अक्सर हाइड्रोजन परमाणुओं (एच) की स्थिति को जानने पर निर्भर करता है और कैसे चार्ज एक प्रोटीन1, 2केभीतर स्थानांतरित कियाजाताहै । चूंकि हाइड्रोजन परमाणु एक्स-रे को कमजोर रूप से तितर-बितर करते हैं, इसलिए उनकी स्थिति केवल बहुत उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे विवर्तन डेटा (>1 Å)3,4केसाथ निर्धारित की जा सकती है। इसके विपरीत, हाइड्रोजन और ड्यूटेरियम (एच2,हाइड्रोजन के आइसोटोप) परमाणुओं के रूप में जैविक मैक्रोमों में हाइड्रोजन परमाणुओं की सटीक स्थिति प्राप्त करने के लिए न्यूट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग किया जा सकताहै। हालांकि, उपलब्ध न्यूट्रॉन स्रोतों से न्यूट्रॉन फ्लक्स एक्स-रे बीम की तुलना में कमजोर है, इसलिए इसे अक्सर2,3के लिए मुआवजा दिया जाना चाहिए। यह एच2 के साथ एच का आदान प्रदान और/या हाइड्रोजन के असंबद्ध बिखरने को कम करने और विवर्तन छवियों के संकेत से शोर अनुपात में वृद्धि करने के लिए क्रिस्टल की मात्रा में वृद्धि करके प्राप्त किया जा सकता है ।
एक्स-रे और न्यूट्रॉन बायो-मैक्रोमॉलिक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी 6 दोनों के लिए बड़े और उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए चित्र 1में विभिन्न क्रिस्टलीकरण दृष्टिकोण (संबंधित योजनाबद्ध चरण आरेख चित्र चित्र1में दिखाया गया है) हैं। वाष्प प्रसार में, एक प्रोटीन और क्रिस्टलीकरण समाधान के मिश्रण से तैयार एक बूंद को समय के साथ, पानी या अन्य अस्थिर प्रजातियों के वाष्पीकरण के माध्यम से, एक जलाशय के खिलाफ समान क्रिस्टलीकरण समाधान के तेज़ की उच्च एकाग्रता वाले जलाशय के खिलाफ समतुल्य किया जाता है। बूंदों में प्रोटीन की सांद्रता में वृद्धि और इसके बाद सहज नाभिक के लिए आवश्यक अधिसंक्षण होता है और इसके बाद इन नाभिक6,7में क्रिस्टल वृद्धि होती है । यद्यपि वाष्प प्रसार क्रिस्टलउगानेके लिए सबसे अधिक बार उपयोग की जाने वाली तकनीक है , लेकिन क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया को ठीक से नियंत्रित नहीं किया जा सकताहै 8. मुफ्त इंटरफ़ेस प्रसार विधि में, क्रिस्टलीकरण समाधान एक केंद्रित प्रोटीन समाधान में फैलता है, जो सिस्टम को सुपरसैचुरेशन की ओर निर्देशित करता है। इस विधि को बैच विधि माना जा सकता है जिसमें धीमी मिश्रण दर6,9 ,10,11,12. बैच विधि में, प्रोटीन को तेजी से क्रिस्टलीकरण समाधान के साथ मिलाया जाता है जिससे तेजी से सुपरसैचुरेशन होता है और बदले में कई क्रिस्टल3, 7के साथ एक समान नाभिकहोताहै। यह विधि वर्तमान में प्रोटीन डेटा बैंक में जमा सभी संरचनाओं में से लगभग एक तिहाई के लिए खातों । डायलिसिस विधि का उपयोग उच्च गुणवत्ता वाले और अच्छी तरह से विवर्तन प्रोटीन क्रिस्टल उगाने के लिए भी किया जाता है। डायलिसिस विधि में, प्रोटीन समाधान के साथ एक अलग कक्ष में अर्ध-पारगम्य झिल्ली के माध्यम से जलाशय से तेज़ फैलाना के अणु। संतुलन की गतिज विभिन्न कारकों पर निर्भर है, जैसे तापमान, झिल्ली ताकना आकार, और प्रोटीन के नमूनों और क्रिस्टलीकरण एजेंटों की मात्रा और एकाग्रता6।
प्रोटीन के विभिन्न राज्यों को विभिन्न भौतिक या रासायनिक चर3के कार्य के रूप में वर्णन करने के लिए क्रिस्टलीकरण चरण आरेख का उपयोग किया जा सकता है। जैसा कि चित्र 1में दर्शाया गया है , प्रत्येक क्रिस्टलीकरण तकनीक को ऐसे आरेख6, 10,13के नाभिक और मेटास्टेबल क्षेत्रों तक पहुंचने के लिए एक अलग गतिज प्रक्षेपवक्र का उपयोग करने के रूप में कल्पना की जा सकती है । यह प्रोटीन घुलनशीलता और प्रोटीन एकाग्रता के बारे में जानकारी प्रदान करता है जिस पर क्रिस्टल और समाधान के बीच थर्मोडायनामिक संतुलन देखा जाता है, जिससे नाभिक और विकास3,14के लिए इष्टतम स्थितियां मिल जाती हैं। दो आयामी चरण आरेख में, प्रोटीन एकाग्रता को एक चर के कार्य के रूप में प्लॉट किया जाता है और अन्य चरों को स्थिर15रखा जाता है। ऐसे चरण आरेख में, जब प्रोटीन एकाग्रता घुलनशीलता वक्र से नीचे होती है, तो समाधान अंडरसैचुरेटेड क्षेत्र में होता है और कोई नाभिक या क्रिस्टल विकास नहीं होता है। इस वक्र के ऊपर अधिसंखन क्षेत्र है जहां प्रोटीन की एकाग्रता घुलनशीलता सीमा3,14से अधिक है । यह आगे तीन क्षेत्रों में विभाजित है: मेटास्टेबल जोन, सहज नाभिक क्षेत्र, और वर्षा क्षेत्र। मेटास्टेबल क्षेत्र में, नाभिक के लिए उचित समय के भीतर होने के लिए अतिसंवता पर्याप्त नहीं है लेकिन वरीयता प्राप्त क्रिस्टल का विकास हो सकता है। वर्षा क्षेत्र में एकत्रीकरण और वर्षा का पक्ष लिया जाता है, जहां अधिसंवता बहुत अधिक है14,15।
जब सहज नाभिक के लिए पर्याप्त अधिसंवता प्राप्त की जाती है, तो पहला नाभिक10दिखाई देगा। क्रिस्टल के बढ़ने से जब तक घुलनशीलता की सीमा नहीं पहुंच जाती तब तक प्रोटीन एकाग्रता में कमी आ जाती है। जब तक अतिशयशीलता घुलनशीलता वक्र के आसपास रहता है, तब तक क्रिस्टल के आकार में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं होगा। हालांकि, यह दिखाया गया है कि क्रिस्टलीकरण समाधान के तापमान और रासायनिक संरचना में भिन्नता (उदाहरण के लिए, तेज़ की एकाग्रता) प्रोटीन घुलनशीलता को प्रभावित करेगी और आगे क्रिस्टल विकास8,13,16की शुरुआत हो सकती है।
चूंकि डायलिसिस अच्छी गुणवत्ता वाले क्रिस्टल विकास के लिए लाभप्रद है, इसलिए चित्रा 2में सचित्र ऑप्टिक्रिस क्रिस्टलाइजेशन बेंच को पूरी तरह से स्वचालित तरीके से क्रिस्टलीकरण को नियंत्रित करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में डिजाइन और विकसित किया गया था8। इस उद्देश्य के लिए, सॉफ्टवेयर LabVIEW के साथ लिखा गया था जो एक इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रक और चिलर के माध्यम से पेल्टियर तत्वों के संपर्क में एक बहने वाले जलाशय डायलिसिस सेटअप के तापमान के नियंत्रण और निगरानी की अनुमति देता है। यही सॉफ्टवेयर मल्टीचैनल फ्लूइड सिस्टम का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण समाधान (उदाहरण के लिए क्रिस्टलीकरण एजेंटों का आदान-प्रदान) की रासायनिक संरचना को स्वचालित रूप से नियंत्रित करता है। इसके अतिरिक्त, एक डिजिटल कैमरा और एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया की कल्पना और रिकॉर्ड करने के लिए किया जाता है। 15 माइक्रोन और 250 माइक्रोन वॉल्यूम वाले दो क्रिस्टलीकरण कक्ष विभिन्न उद्देश्यों के लिए क्रिस्टल उगाने के लिए उपलब्ध हैं। चूंकि क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया प्रतिवर्ती है, इसलिए प्रोटीन समाधान के कुछ माइक्रोलीटर के साथ विभिन्न स्थितियों के लिए स्क्रीनिंग संभव है जब तक कि नमूना क्षतिग्रस्त नहींहोता 8। नतीजतन, इस विधि का उपयोग करने से उपयोग की जाने वाली प्रोटीन सामग्री की मात्रा कम हो जाती है।
पिछले काम8से, यह स्पष्ट है कि क्रिस्टल विकास प्रक्रिया के दौरान, सीटू टिप्पणियों में नियमित समय अंतराल पर किए जाने की आवश्यकता होती है। ये कुछ सेकंड से लेकर कई दिनों तक हो सकते हैं, जो अवलोकन (वर्षा, नाभिक या क्रिस्टल विकास) के तहत घटना पर निर्भर करता है।
ऑप्टीक्रिस्ट के साथ क्रिस्टल विकास का अनुकूलन तापमान-तेज़ एकाग्रता चरण आरेख पर आधारित है। तापमान के प्रत्यक्ष कार्य के रूप में घुलनशीलता वाले प्रोटीन के मामले में, नमकीन-आउट शासन18का उपयोग करना संभव है। यह वह जगह है जहां समाधान की आयनिक ताकत में वृद्धि, जिसे प्रोटीन-तेज़ चरण आरेखों का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है, प्रोटीन की घुलनशीलता को कम कर देती है। इसी तरह, विलोम घुलनशीलता वाले प्रोटीन नमकीन-इन शासन18का उपयोग कर सकते हैं । नाभिक नाभिक क्षेत्र में होता है, मेटास्टेबल क्षेत्र के आसपास, और क्रिस्टल विकास तब तक चरण आरेख के मेटास्टेबल क्षेत्र में होता है जब तक कि प्रोटीन एकाग्रता घुलनशीलता सीमा तक नहीं पहुंच जाती है। जैसा कि चित्र 3 एमें दिखाया गया है, निरंतर रासायनिक संरचना तापमान के साथ नए नाभिक को रोकने के लिए मेटास्टेबल क्षेत्र में क्रिस्टलीकरण समाधान रखने के लिए कम किया जा सकता है। क्रिस्टल तब तक बढ़ते हैं जब तक कि दूसरा क्रिस्टल/समाधान संतुलन प्राप्त नहीं हो जाता और उसके बाद क्रिस्टल के आकार में और कोई वृद्धि नहीं देखी जाती है । क्रिस्टल के वांछित आकार तक पहुंचने तक तापमान कई बार कम हो जाता है। चित्रा 3 Bमें, निरंतर तापमान पर, तेज़ एकाग्रता में वृद्धि मेटास्टेबल क्षेत्र में समाधान रखती है। इस प्रक्रिया को फिर बड़े क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए कई बार दोहराया जा सकता है। तापमान को बदलना और क्रिस्टलीकरण समाधान स्थितियों में हेरफेर करना, अतिसंक्षण स्तरों को नियंत्रित करके, नाभिक और क्रिस्टल के विकास को अलग करने के लिए दो शक्तिशाली उपकरण हैं जिन्हेंऑप्टीक्रिस्ट5,8,14द्वारा ठीक और स्वचालित रूप से नियंत्रित किया जाता है।
तापमान नियंत्रित, या तापमान-और तेज़ एकाग्रता-नियंत्रित क्रिस्टलीकरण द्वारा उगाए गए प्रोटीन क्रिस्टल के उदाहरण, साथ ही प्राप्त सापेक्ष विवर्तन डेटा साहित्य और पीडीबी में उपलब्ध हैं। इनमें ह्यूमन γ-क्रिस्टलिन ई, पीए-आईआईएल लेक्टिन, खमीर अकार्बनिक पायरोफोफ्फैटेस, यूरेट ऑक्सीडेस, ह्यूमन कार्बोनिक एंहाइड्रेज II, याचब किनेज, और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज5,14, 17,18हैं।
यद्यपि ऑप्टिक्रिस को नेटएक्स-रे द्वारा व्यावसायीकरण किया गया था, लेकिन कई प्रयोगशालाएं हैं जिनके पास इस उपकरण तक पहुंच नहीं है या यह धारावाहिक दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस तकनीक का विकल्प विभिन्न खंडों के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्टिक माइक्रोडायलिसिस बटन का उपयोग करना है। इनका उपयोग करके, तापमान और रासायनिक संरचना को मैन्युअल रूप से समायोजित और विविध किया जा सकता है। माइक्रोडायलिसिस बटन का निरीक्षण सीटू में नहीं किया जा सकता है और इसके बजाय ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ मैन्युअल रूप से किया जाना चाहिए। कंपन मुक्त तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में नमूना रखकर तापमान नियंत्रण प्राप्त किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए तापमान को स्थिर रखना आवश्यक है कि क्रिस्टलीकरण प्रयोग प्रजनन योग्य हैं। तापमान में उल्लेखनीय भिन्नता से क्रिस्टल का नुकसान या विनाश भी हो सकता है5.
यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसमें नमूना तैयार करने और न्यूट्रॉन प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी के लिए उपयुक्त बड़े, उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल के विकास के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर के उपयोग का वर्णन किया गया है। इस चरण-दर-कदम प्रक्रिया को क्रिस्टलीकरण चरण आरेख का लाभ उठाने के लिए डिज़ाइन किया गया था ताकि आकार और उत्पन्न क्रिस्टल की गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए एक प्रारंभिक स्थिति और गतिज पथ का चयन किया जा सके। इसके अतिरिक्त, माइक्रोडायलिसिस बटन के साथ क्रिस्टल उगाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जो बड़े, उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए एक ही तर्क का उपयोग करता है।
विभिन्न भौतिक, रासायनिक और जैविक चर प्रोटीन घुलनशीलता को प्रभावित करके प्रोटीन क्रिस्टलीकरण को प्रभावित करते हैं21. इन चरों में, क्रिस्टलीकरण समाधान के तापमान और रासायनिक संरचना का उपयोग यहां डायलिसिस तकनीक के संयोजन में किया जाता है ताकि न्यूट्रॉन विवर्तन अध्ययनों के लिए बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स के बड़े उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल को बेहतर और विकसित किया जा सके। चरण आरेखों के ज्ञान का उपयोग करके, क्रिस्टलीकरण को अधिक पूर्वानुमानित बनाया जाता है। हालांकि धारावाहिक दृष्टिकोण में विभिन्न क्रिस्टलीकरण स्थितियों की स्क्रीनिंग भी संभव है, लेकिन प्रस्तुत तर्कसंगत दृष्टिकोणों का उपयोग करने का मुख्य उद्देश्य क्रिस्टल नाभिक और विकास के काइनेटिक्स को अलग और नियंत्रित करना है।
सभी क्रिस्टलीकरण अध्ययनों के समान, उच्च गुणवत्ता वाले शुद्ध और सजातीय प्रोटीन नमूने, और धूल मुक्त क्रिस्टलीकरण समाधान प्रयोग की सफलता दर में वृद्धि करते हैं। निस्पंदन और समाधान के अपकेंद्रित्र वर्णित प्रोटोकॉल में आवश्यक कदम हैं । प्रोटीन के भौतिक रसायन गुणों को जानना जैसे आणविक वजन (उचित डायलिसिस झिल्ली का चयन करने के लिए), आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट, और प्रोटीन घुलनशीलता एक इष्टतम क्रिस्टल विकास प्रयोग के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, नमूना हानि को रोकने और सफलता की संभावना को बढ़ाने के लिए विभिन्न तापमानों पर या विभिन्न रसायनों के साथ प्रोटीन स्थिरता के लिए विचार किया जाना चाहिए। ऑप्टीक्रिस्ट (233.0-353.0 ± 0.1 K) के तापमान सीमा को ध्यान में रखते हुए, प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करके क्रिस्टलीकृत किया जा सकता है। लेकिन यह तनाव के लायक है कि प्रोटीन है कि मुख्य रूप से थर्मो स्थिर हैं, जैसे थर्मोफिलिक स्रोतों से प्रोटीन, तापमान में सबसे अधिक लाभ होगा बड़ी मात्रा में क्रिस्टल विकास इस उपकरण द्वारा की पेशकश प्रयोगों को नियंत्रित ।
कम मात्रा वाले डायलिसिस कक्ष (ऑप्टिक्रिस्टिस का उपयोग करते समय) या माइक्रोडायलिसिस बटन का उपयोग करना और कई तापमान और क्रिस्टलीकरण की स्थिति (उदाहरण के लिए, तेज़ एकाग्रता या पीएच के ग्रिड) की स्क्रीनिंग करना, मेटास्टेबल जोन (नाभिक और मेटास्टेबल क्षेत्रों के बीच गतिज संतुलन) की सीमा के स्थान के बारे में जानकारी प्राप्त करना संभव है। यह अमूल्य है जब विशेष रूप से क्रिस्टलीकरण में नए प्रोटीन उम्मीदवारों के लिए एक सफल क्रिस्टल विकास प्रयोग डिजाइन। इस जानकारी के बिना प्रयोग उच्च सुपरसैचुरेशन के साथ चरण आरेख के क्षेत्र से शुरू हो सकते हैं, आसानी से क्रिस्टल नाभिक को नियंत्रित करने के लिए मेटास्टेबल क्षेत्र की सीमा से बहुत दूर। हालांकि प्रोटीन वर्षा के विघटन का प्रयास किया जा सकता है, उदाहरण के लिए प्रत्यक्ष घुलनशीलता के मामले में तापमान में वृद्धि करके, कम थर्मोस्थायिटी वाले प्रोटीन के लिए, नमूने को लंबे समय तक उच्च तापमान पर रखने से प्रोटीन वर्षा अपरिवर्तनीय हो सकती है। इस प्रकार, सबसे अच्छी रणनीति में मेटास्टेबिलिटी की सीमा के पास स्थित कम अतिसंवता के साथ एक प्रारंभिक स्थिति का उपयोग करना होता है, जहां नाभिक को नियंत्रित किया जा सकता है और प्रोटीन वर्षा से बचा जा सकता है। इसके अनुरूप, क्रिस्टलीकरण प्रीस्क्रीनिंग डायलिसिस कक्ष में प्रोटीन होने की संभावना को कम कर देता है और प्रयोग की सफलता दर को बढ़ाता है।
एक प्रयोग डिजाइन करने के बाद, डायलिसिस कक्षों (ऑप्टीक्रिस्ट) या माइक्रोडायलिसिस बटन तैयार करना एक और महत्वपूर्ण कदम है। डायलिसिस कक्ष/बटन में हवा बुलबुला गठन को रोकने के सफल क्रिस्टलीकरण की संभावना बढ़ जाती है, खासकर जब छोटी मात्रा का उपयोग किया जाता है । डायलिसिस कक्ष में हवा के बुलबुले की उपस्थिति क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया के गतिज को भी बदल सकती है और प्रयोग की प्रजनन क्षमता को कम कर सकती है (क्योंकि प्रोटीन/समाधान संपर्क सतह को संशोधित किया गया है)। न केवल प्रोटीन बल्कि क्रिस्टलीकरण समाधान भी प्रयोग की सफलता को प्रभावित कर सकता है। पंपिंग प्रणाली के लिए नए 50 एमएल ट्यूब का उपयोग करना हर बार एक नया प्रयोग शुरू करना चाहता है और प्रत्येक प्रयोग के बाद टयूबिंग धोने से संदूषण की संभावना कम हो जाती है और उपकरण में नमक क्रिस्टल के निर्माण से बचा जाता है।
जब ऑप्टीक्रिस्टे उपलब्ध नहीं होता है तो माइक्रोडायलिसिस बटन का उपयोग एक विकल्प है। ऊपर उल्लिखित क्रिस्टलीकरण और निगरानी क्रिस्टल विकास के अनुकूलन के लिए रणनीतियों को मैन्युअल रूप से किया जाना चाहिए। आमतौर पर यह एक थर्मोरैलेनियमित इनक्यूबेटर के बाहर होने की आवश्यकता होती है, जो समस्याग्रस्त हो सकता है जब तापमान विनियमन वर्णित पद्धति में एक महत्वपूर्ण कदम है। यह क्रिस्टलीकरण समाधानों की रासायनिक संरचना को बदलने, या इमेजिंग द्वारा क्रिस्टल विकास की निगरानी करने की सुविधा नहीं देता है, इसलिए क्रिस्टल विकास प्रक्रिया को वास्तविक समय में नियंत्रित नहीं किया जा सकता है।
चरण आरेख का ज्ञान एक स्वचालित फैशन में बड़े, उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल को व्यवस्थित रूप से विकसित करने के लिए क्रिस्टलीकरण बेंच, ऑप्टीक्रिस्ट का उपयोग करने का आधार है। क्रिस्टलीकरण के दौरान तापमान, तेज़ एकाग्रता और पीएच जैसे भौतिक रसायनीय मापदंडों का नियंत्रण प्रोटीन-समाधान संतुलन को चरण आरेख में एक अच्छी तरह से परिभाषित गतिज प्रक्षेपवक्र में ले जाता है। यह बड़े पैमाने पर परिवहन को समायोजित करने और क्रिस्टलीकरण कक्ष में एक नियंत्रित ढाल बनाने के लिए डायलिसिस झिल्ली के उपयोग से पूरित होता है जो क्रिस्टल के आकार और गुणवत्ता को प्रभावित करता है। इसलिए, उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल विकसित करने के लिए क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए थर्मोडायनामिक डेटा और गतिज पथ दोनों का उपयोग करना आवश्यक है। ऑप्टीक्रिस्ट के लिए धन्यवाद, बहुआयामी अंतरिक्ष में व्यवस्थित चरण आरेखों का अध्ययन धारावाहिक दृष्टिकोण के साथ पहले की तुलना में काफी कम सामग्री का उपयोग करके किया जा सकता है। इस पद्धति को प्रदर्शित करने के लिए, हम यहां एक मॉडल प्रोटीन, चिकन अंडे-सफेद lysozyme के साथ एक मामला अध्ययन प्रदान करते हैं । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके और उसमें महारत हासिल करके कोई भी इसे वास्तविक प्रोटीन प्रणालियों5, 14,17,18केलिए अनुकूलित कर सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
एमबीएस अनुबंध 2015 के तहत लैबेक्स वैलो जीआरएएल से समर्थन को स्वीकार करता है। एनजे पीएचडी फैलोशिप के लिए सीईए के इंटरनेशनल डॉक्टोरल रिसर्च प्रोग्राम (Irtelis) को स्वीकार करता है । लेखक मैरी Skłodowska-क्यूरी अनुदान समझौते संख्या ७२२६८७ के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन स्वीकार करते हैं । लेखक सहायक बातचीत और अंतर्दृष्टि के लिए डॉ एस्को ओक्सैन (ईएसएस, लुंड) और डॉ जीन-ल्यूक फेरर (आईबीएस, ग्रेनोबल) के आभारी भी हैं। आईबीएस ग्रेनोबल के अंतःविषय अनुसंधान संस्थान (IRIG, सीईए) में एकीकरण को स्वीकार करता है ।
200 µl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-330 | Dialysis button |
24 well plates | Jena Bioscience | CPL-132 | Crystallization plate |
2-Switch | FLUIGENT | 2SW001 | Switch |
30 μl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-324 | Dialysis button |
50 mL Corning Centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828-500EA | Centrifuge tubes |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | S2889 | Chemical |
Chicken Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Lyophilized protein powder |
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132478 | Dialysis membrane |
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132650T | Dialysis membrane |
Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin | Bench-top centrifuge |
Flow Unit | FLUIGENT | FLU-XL | Flow meter |
Flowboard | FLUIGENT | FLB | Flowboard |
Microfluidic Flow Control System EZ | FLUIGENT | EZ-01000002 | Pressure/vacuum controller |
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters | Millipore | GSWP04700 | 0.22 μm pore size filter |
M-Switch | FLUIGENT | MSW002 | Rotary valve |
Opticrys | NatX-ray | PRT008 | Crystallization bench |
Siliconized circle cover slides | Hampton Research | HR3-231 | Glass slides |
Sodium Chloride ≥ 99% | Sigma-Aldrich | 746398 | Chemical |
Switchboard | FLUIGENT | SWB002 | Switchboard |
Thermoregulated incubator | Memmert | IPP30 | Thermoregulated incubator |