Visualizzazione di incontri replisali con una lesione bloccante con tag antigene

Jing Zhang; Jing Huang; Ishani Majumdar; Ryan C. James; Julia Gichimu; Manikandan Paramasivam; Durga Pokharel; Himabindu Gali; Marina  A. Bellani; Michael  M Seidman

doi:10.3791/61689

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Articolo metodologico

Visualizzazione di incontri replisali con una lesione bloccante con tag antigene

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DOI:

10.3791/61689

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27 luglio 2021

Jing Zhang^*¹ , Jing Huang^*² , Ishani Majumdar¹ , Ryan C. James³ , Julia Gichimu¹ , Manikandan Paramasivam⁴ , Durga Pokharel⁵ , Himabindu Gali⁶ , Marina A. Bellani¹ , Michael M Seidman¹

¹Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, ²Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, ³Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, ⁴Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, ⁵Horizon Discovery, ⁶Boston University School of Medicine

^* These authors contributed equally

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Sommario

Mentre le collisioni della forcella di replicazione con gli addotti del DNA possono indurre rotture a doppio filamento, meno si sa sull'interazione tra replisomi e lesioni bloccanti. Abbiamo impiegato il saggio di legatura di prossimità per visualizzare questi incontri e per caratterizzare le conseguenze per la composizione delle risposte.

Abstract

Sono presenti informazioni considerevoli sulla risposta cellulare alle rotture a doppio filamento (DSB), indotte da nucleasi, radiazioni e altri rompitori di DNA. In parte, ciò riflette la disponibilità di metodi per l'identificazione dei siti di rottura e la caratterizzazione dei fattori reclutati per i DSB in tali sequenze. Tuttavia, i DSB appaiono anche come intermedi durante l'elaborazione di addotti del DNA formati da composti che non causano direttamente rotture e non reagiscono in siti di sequenza specifici. Di conseguenza, per la maggior parte di questi agenti, le tecnologie che consentono l'analisi delle interazioni di legame con i fattori di risposta e le proteine di riparazione sono sconosciute. Ad esempio, i legami incrociati tra filamenti di DNA (ICL) possono provocare rotture in seguito a incontri di fork di replicazione. Sebbene formata da farmaci ampiamente usati come chemioterapici del cancro, non esiste una metodologia per monitorare le loro interazioni con le proteine di replicazione.

Qui, descriviamo la nostra strategia per seguire la risposta cellulare alle collisioni della forcella con questi addotti impegnativi. Abbiamo collegato un antigene steroideo allo psoralene, che forma ICL dipendenti dalla fotoattivazione nei nuclei delle cellule viventi. Le ICL sono state visualizzate mediante immunofluorescenza contro il tag dell'antigene. Il tag può anche essere un partner nel Proximity Ligation Assay (PLA) che riporta la stretta associazione di due antigeni. Il PLA è stato sfruttato per distinguere le proteine che erano strettamente associate alle ICL marcate da quelle che non lo erano. È stato possibile definire le proteine replisome che sono state trattenute dopo incontri con ICL e identificare altre che sono state perse. Questo approccio è applicabile a qualsiasi struttura o addotto del DNA che può essere rilevato immunologicamente.

Introduzione

La risposta cellulare alle rotture del doppio filamento è ben documentata a causa di una successione di metodi sempre più potenti per dirigere le rotture verso siti genomici specifici ^1,2,3. La certezza della posizione consente una caratterizzazione univoca delle proteine e di altri fattori che si accumulano nel sito e partecipano alla risposta al danno del DNA (DDR), guidando così i percorsi di giunzione finale non omologa (NHEJ) e ricombinazione omologa (HR) che riparano le rotture. Naturalmente, molte rotture sono introdotte da agenti come radiazioni e specie chimiche che ....