Ensayos de la enfermedad de ladrido de raíz seca en el garbanzo: una metodología detallada
Summary
Este estudio presenta metodologías para estudiar los mecanismos patomorfoológicos y moleculares subyacentes a la interacción entre garbanzo yrizoctonia bataticola. El método del papel hinchado es útil para estudiar rápidamente las respuestas del genotipo del garbanzo, mientras que el método de la olla enferma se puede utilizar para imponer simultáneamente la sequía y la infección por R. bataticola y la pantalla tolerante a los genotipos.
Abstract
La enfermedad de la putrefacción de la raíz seca (DRR) es una amenaza emergente de estrés biótico para el cultivo de garbanzos en todo el mundo. Es causada por un patógeno fúngico transmitido por el suelo, Rhizoctonia bataticola. En la literatura, los protocolos paso a paso completos y detallados sobre los ensayos de enfermedades son escasos. Este artículo proporciona detalles completos sobre los pasos involucrados en la configuración de una técnica de papel hinchado para la detección rápida de genotipos para la resistencia a la RR. La técnica del papel hinchado es fácil y menos costosa. Otro método, basado en el enfoque de la olla enferma, es una imitación de la infección natural y se puede aplicar para estudiar los componentes que interactúan (planta, patógeno y medio ambiente) involucrados en el triángulo de la enfermedad.
Además, en la naturaleza, la RR se produce principalmente en las zonas de cultivo de garbanzos de secano, donde la humedad del suelo retrocede a medida que avanza el crecimiento de los cultivos. Se sabe que el estrés por sequía predispone a las plantas de garbanzos a la enfermedad de la RR. La comprensión patomorfológica y molecular de la interacción entre plantas y patógenos bajo estrés por sequía puede allanar el camino para la identificación de variedades élite resistentes a la RR desde la reserva de germoplasma de garbanzos. Este artículo proporciona una metodología escalonada para la preparación de una olla enferma y el posterior ensayo de la enfermedad. En general, la información presentada en este documento ayudará a los investigadores a preparar el inóculo fúngico R. bataticola, mantener este patógeno, establecer la técnica de papel de hinchazón, preparar el cultivo enfermo y la olla enferma, y evaluar la infección por patógenos en plantas de garbanzos.
Introduction
La podredumbre de la raíz seca (DRR) es una de las enfermedades económicamente significativas en el garbanzo1,2. Es una enfermedad específica de la raíz causada por Rhizoctonia bataticola (teleomorfo, Macrofomina phaseolina). Las plantas infectadas carecen de raíces laterales y poseen raíces quebradizas y follaje amarillo1,3. Se ha informado que el estrés por DRR bajo sequía es una amenaza emergente para el cultivo de garbanzos1,2,3. Además, se ha informado que la incidencia de la RR se ha agravado en condiciones de sequía en condiciones de campo1,2,3. DrR es más frecuente en las zonas de secano que en los campos de regadío4. La utilización de variedades resistentes es la manera de superar la enfermedad y eludir el uso defungicidas 1,13. Debido a que el germoplasma de garbanzos disponible en todo el mundo alberga una variación genética para el rasgo5,el cribado e identificación de genotipos resistentes/susceptibles son críticos para la cría molecular para la mejora de los cultivos.
Los ensayos de enfermedades robustos, fáciles y rentables son esenciales para investigar los patrones de infección por R. bataticola en el garbanzo. El ensayo de enfermedad primaria utilizado para observar la respuesta de los genotipos de garbanzos a la infección por R. bataticola es la técnica de papel hinchado1,4. Es una técnica simple y se puede ejecutar utilizando inóculo de hongos líquidos, plántulas con raíces y papel de hinchazón estéril. Sin embargo, esta técnica no se ha utilizado al máximo porque no hay ningún protocolo paso a paso disponible en la literatura.
Mientras tanto, la técnica de la olla enferma implica la preparación de un posible cultivo enfermo y la imposición de estrés por sequía. Dado que el estrés por sequía agrava la incidencia de la enfermedad de la RR3, es esencial estudiar la interacción planta-patógeno bajo estrés por sequía6,7. La técnica de la olla enferma proporciona la plataforma para un estudio simultáneo, promoviendo mejores posibilidades para el cribado del germoplasma y la comprensión de la base mecanicista de la interacción. Los cambios patomorfológicos, como el aumento de la longitud de la raíz y la reducción del número de raíz lateral, inherentes a la enfermedad de RR, se pueden abordar utilizando la técnica de la maceta enferma1,3,7.
En este documento, se presenta un protocolo detallado para el papel hinchado y las técnicas de maceta enferma, que se puede utilizar para estudiar la interacción entre el garbanzo y R. bataticola y el germoplasma de garbanzos de pantalla. Los detalles de los materiales utilizados en el estudio se indican en la Tabla de materiales.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica del papel hinchado proporciona un enfoque sencillo para examinar los genotipos de garbanzos en condiciones de laboratorio. La inoculación por inmersión permite la investigación de la interacción de forma temporal con un fácil control sobre la carga de inóculo(Figura complementaria 1) y facilita el cribado in vitro. Además, incluso se pueden utilizar plántulas jóvenes. El cultivo de hongos de cinco días de edad (Figura 1B) puede producir suficiente inóc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los proyectos en el laboratorio M.S.K cuentan con el apoyo de la financiación básica del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Vegetal. VI reconoce DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Agradecemos a las estudiantes en prácticas, a la señorita Rishika, al Sr. Jayachendrayan y a la señorita Durgadevi por la ayuda técnica durante el rodaje de vídeo y al Sr. Sandeep Dixit, a la señorita Anjali y al Dr. Avanish Rai por evaluar críticamente los datos en bruto y los archivos manuscritos. Agradecemos al Sr. Rahim H Tarafdar y al Sr. Sunder Solanki su ayuda en el laboratorio. Reconocemos al Consorcio DBT-eLibrary (DeLCON) y a la Biblioteca NIPGR por proporcionar acceso a los recursos electrónicos y al Fondo de Crecimiento de Plantas NIPGR para el apoyo/espacio para el crecimiento de la planta.
Materials
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
Riferimenti
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