Torr Rot Disease Assays i Kikärter: en detaljerad metodik
Summary
Denna studie presenterar metoder för att studera de pathomorphological och molekylära mekanismerna bakom kikärter–Rhizoctonia bataticola interaktion. Metoden blotting papper är användbart för att snabbt studera kikärt genotyp svar, medan den sjuka pot-baserade metoden kan användas för att samtidigt införa torka och R. bataticola infektion och skärm för tolerant genotyper.
Abstract
Torr rotröta (DRR) sjukdom är en framväxande biotisk stress hot mot kikärter odling runt om i världen. Det orsakas av en jordburen svamp patogen, Rhizoctonia bataticola. I litteraturen är omfattande och detaljerade steg-för-steg-protokoll om sjukdomsanalyser glesa. Den här artikeln innehåller fullständiga detaljer om de steg som är inblandade i att inrätta en blotting papper teknik för snabbt screening genotyper för resistens mot DRR. Den blotting papper teknik är lätt och billigare. En annan metod, baserad på den sjuka potten strategi, är en härma av naturlig infektion och kan tillämpas för att studera de samverkande komponenterna-växt, patogen, och miljö-deltar i sjukdomstriangeln.
Dessutom, i naturen, drr förekommer främst i regnfed kikärter odlingsområden, där marken fukt avtar som gröda tillväxt framsteg. Torka stress är känt för att predisponera kikärter växter till DRR sjukdom. Patologiska och molekylär förståelse av växt-patogen interaktion under torka stress kan bana väg för identifiering av eliten DRR-resistenta sorter från kikärter germplasm poolen. Denna artikel ger en stegvis metodik för utarbetandet av en sjuk potten och efterföljande sjukdom assay. Sammantaget kommer den information som presenteras häri hjälpa forskare att förbereda R. bataticola svamp inokulat, upprätthålla denna patogen, ställa in blotting papper teknik, förbereda sjuka kultur och sjuka potten, och bedöma patogen infektion i kikärter växter.
Introduction
Torr rotröta (DRR) är en av de ekonomiskt signifikanta sjukdomarna ikikärter 1,2. Det är en rot-specifik sjukdom som orsakas av Rhizoctonia bataticola (teleomorf, Macrophomina phaseolina). Infekterade växter saknar laterala rötter och besitter spröda taproots och gult lövverk1,3. DRR under torka stress har rapporterats vara ett framväxande hot mot kikärter odling1,2,3. Drr-incidensen uppges dessutom förvärras under torkans stress under fältförhållanden1,2,3. DRR är vanligare i regnade områden än i bevattnade fält4. Utnyttjandet av resistenta sorter är sättet att övervinna sjukdomen och kringgå fungicid användning1,13. Eftersom kikärtermplasm finns över hela världen hamnar genetisk variation föregenskapen 5, screening och identifiering av resistenta / mottagliga genotyper är avgörande för molekylär avel för gröda förbättring.
Robust, lätt, och kostnadseffektiva sjukdomsanalyser är avgörande för att undersöka R. bataticola infektion mönster i kikärter. Den primära sjukdomsanalys som används för att observera svaret av kikärts genotyper på R. bataticola infektion är blotting papper teknik1,4. Det är en enkel teknik och kan utföras med hjälp av flytande svamp inokulat, plantor med rötter, och sterila blotting papper. Denna teknik har dock inte utnyttjats till sitt maximum eftersom ingen steg-för-steg-protokoll finns i litteraturen.
Samtidigt innebär den sjuka potten tekniken utarbetandet av en potentiell sjuk kultur och införandet av torka stress. Med tanke på att torkan stress förvärrar DRRsjukdomsincidens 3, är det viktigt att studera växt-patogen interaktion under torka stress6,7. Den sjuka potten tekniken ger plattformen för en sådan samtidig studie, främja bättre möjligheter för germplasm screening och förstå den mekanistiska grunden för interaktionen. Patologiska förändringar som en ökning av rotlängd och minskning av lateralt rottal—inneboende till DRR sjukdom—kan åtgärdas med hjälp av den sjukakrukan tekniken 1,3,7.
Häri presenteras ett detaljerat protokoll för blotting papper och sjuka pot tekniker, som kan användas för att studera samspelet mellan kikärter och R. bataticola och skärmen kikärtermplasm,. Detaljerna i de material som används i studien anges i tabellen över material.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den blotting papper tekniken ger en enkel metod för att skärmen kikärt genotyper under laboratorieförhållanden. Dip-inympning möjliggör utredning av interaktion på tidsmässig basis med enkel kontroll över inokulatbelastning (Kompletterande Figur 1) och underlättar in vitro-screening. Vidare kan även unga plantor användas. Fem dagar gammal svampkultur ( Figur1B) kan ge tillräckligt med inokulat för att infektera växterna. Flytande inokulat innehåller både my…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projekt vid M.S.K lab stöds av National Institute of Plant Genome Research kärnfinansiering. VI erkänner DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Vi tackar praktikant studenter, Miss Rishika, Mr Jayachendrayan, och Miss Durgadevi för teknisk hjälp under videoinspelning och Mr Sandeep Dixit, Miss Anjali och Dr Avanish Rai för kritiskt bedöma rådata och manuskriptet filer. Vi tackar mr Rahim H Tarafdar och mr Sunder Solanki för deras hjälp i laboratoriet. Vi erkänner DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) och NIPGR Library för att ge tillgång till e-resurser och NIPGR Plant Growth Facility för växttillväxt stöd / utrymme.
Materials
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
Riferimenti
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea – where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. . Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. . Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
