阿斯蒂亚纳克斯墨西哥最大育种和产卵的增量温度变化
Summary
本文概述了增加温度机制的基本实验室条件和协议，以刺激墨西哥四 阿斯蒂亚纳克斯墨西哥最大的产卵，这是一个新兴的模式，发展和进化研究。
Abstract
墨西哥四重奏， 墨西哥阿斯蒂安娜克斯，是一个新兴的模型系统，用于研究发展和进化。该物种中存在眼表（表面鱼）和盲洞（洞穴鱼）形态，为探讨形态和行为进化背后的机制提供了机会。洞穴鱼已经进化出新的建设性和倒退性特征。建设性的变化包括味蕾和下颚、横向线感官器官和身体脂肪的增加。递减变化包括眼睛的丧失或减少。黑色素色素沉着，学校行为，侵略和睡眠。为了对这些变化进行实验性审讯，获得大量产卵胚胎至关重要。自20世纪90年代在德克萨斯和墨西哥采集了最初的 A.墨西哥 表面鱼类和洞穴鱼以来，它们的后代经常受到刺激，在杰弗瑞实验室两个月繁殖和产卵大量胚胎。虽然繁殖受食物丰度和质量、光暗周期和温度的控制，但我们发现增量温度变化在刺激最大产卵方面起着关键作用。在繁殖周的头三天，温度从72°F逐渐升高到78°F，这为连续两三个产卵日提供了数量最大的优质胚胎，随后在产卵周的最后三天，温度从78°F逐渐降至72°F。本视频中显示的程序概述了实验室育种周之前和期间的工作流程，以增加温度刺激产卵。
Introduction
电传阿斯蒂亚纳克斯墨西哥有一个眼睛表面居住（表面鱼）的形式和许多不同的盲洞居住（洞穴鱼）形成1，2。洞穴鱼在永久的黑暗和食物的限制下进化，导致新颖的建设性和倒退性状的出现3。建设性特征包括味蕾和下颚尺寸的增加、横向线的感官器官和脂肪储备。递减特征包括黑色素色素沉着、眼睛和行为（如睡眠、教育和攻击）的丧失或减少。Astyanax系统的一个属性是两种形式之间的完全生育能力，允许使用定量特征 （QTL） 映射来确定与建设性和倒退进化相关的基因组区域 4、5、6、7 。A. 墨西哥人为研究开发提供了一个有利的系统，因为它可以诱导在实验室中频繁产卵。A.墨西哥人的胚胎是半透明的，比斑马鱼的胚胎稍大，大量产生，并在大约8-12个月内发育成性成熟的成年人。他们最大的产卵能力期约为5年。该协议描述了典型的繁殖周期间A. mexicanus养殖设施所需的工作流程，并包括鱼类系统维护的细节和最大产卵的温度控制制度。
A. 墨西哥鱼 是一种热带鱼，生活在源自石灰岩高原（地表鱼）的河流中，生活在石灰岩洞穴（洞穴鱼）8的池中。石灰石溶解产生硬水， 墨西哥在 硬水中茁壮成长。适应硬水条件的鱼可以承受一系列咸味条件，但一般在特定条件下繁殖。产卵行为的诱导是由多种因素综合完成的。由于鱼是冷血的，依靠他们的环境来维持平衡，它们的新陈代谢对环境变化很敏感，它们对压力源的反应更快。 A. 墨西哥人 应在水流、pH、导电性、渗透压力、照明和水温等严格调节的条件下在水生系统中培养。
在杰弗瑞实验室，鱼类被维持在两个自来水系统中：（1） 性成熟前为年轻成年鱼建立”婴儿系统”;（2） 性成熟、繁殖成人的成人（或主要）系统。”婴儿系统”由8L和15L水箱组成，提供自来水。”婴儿系统”由鱼苗和幼年变质幼虫在较小的（1-10升）水箱中生长，每周交换水。幼虫、鱼苗和幼鱼极度依赖食物，必须每天喂活食物（盐水虾）一次，以确保高存活率。”婴儿系统”的青少年在大约1-1.5年后被安置在成人系统。起初，他们被喂给粉碎的四片，进一步生长后，他们被转移到常规的成人喂养制度。性成熟度可以用女性的腹部体积来评估，确定性别的方法已经描述了11。在成人系统中，每 24 小时在 42 L 水箱中自动交换水 3 次。成人系统每天通过视觉检查和来自探头的自动温度、pH和导电读数进行监控。最佳pH度在7.4左右，范围在6.8-7.5之间，系统的基本温度为72/73°F，理想导电范围在600-800 mS之间。 自动读数显示在控制器屏幕上，在分布在整个系统的流量计上可视化水压检查。通过测试温度和使用色度测试测量pH值、氨和硝酸盐的水质参数，每周对水质进行独立检查。通过在系统中添加有益细菌（如 Nutafin 循环），氨和硝酸盐水平保持在或接近于零。房间照明由调至14小时光线和10小时黑暗时段的分时器控制。除了上述总体水质参数外，以下考虑在繁殖周期间需要特别注意。
第一个考虑是光周期，因为鱼（甚至在实验室中的洞穴鱼）依赖于光循环来设置他们的昼夜时钟。昼夜节律可以影响一切从繁殖和喂养到免疫系统健康12，13，必须保持一致，以获得最大的健康益处。鱼在14小时光和10小时暗光下保持在自来水系统中。表面鱼类通常在系统变暗一小时后开始产卵，在此期间引入的光线可能会干扰和终止产卵。盲洞鱼的产卵较少受到光线的干扰。与地表鱼类产卵相比，洞穴鱼类的产卵延迟，通常在系统变暗后四到五个小时开始。
第二个考虑因素是营养。成年鱼通常每天吃一次四片。在产卵之前，鱼类被喂养富含蛋白质的饮食，辅以额外的四片片和其他食物：蛋黄片和偶尔生活加州黑虫（Lumbriculus品种），以弥补在上一个产卵周期中因卵子生产而造成的蛋白质损失。在繁殖周期间，每天喂鱼两次，早上喂一次，下午/晚上再喂一次。鱼每天只喂一次，但与一个非常大的食物，应该避免，因为这可能导致营养不良14。
第三个考虑因素是空间。空间要求基于成人的平均身体质量以及行为考虑，例如鱼是否有上学行为或攻击行为。过度或拥挤的水箱可能导致更高的侵略性和持续的压力，使鱼容易受到伤害，从他们的坦克队友和不愿意参与产卵15。我们通常每42L水箱容纳10-20条鱼。
第四个考虑因素是温度。如上所述，鱼是冷血动物，依靠环境来维持体温。由于温度对代谢过程有直接影响，温度变化会引发鱼类的行为改变。此育种计划包括两周的温度周期：第一周将温度峰值引入 78 °F，下周保持 72 °F 的静态温度。 在第一个（育种）周，每天晚上将塑料边缘育种网放置在罐底。养殖网充当鱼缸中的鱼和产卵之间的屏障，否则这些卵子将被消耗掉。温度在本周中将每天提高 2 °F 至最高 78 °F，并根据本周前 2-3 个晚上的光周期诱发产卵。然后，在一周的剩余天数内，温度将降低 2 °F 增量至 72 °F，并将基本温度保持到下一个育种周的开始。繁殖通常每月刺激不超过两次，让鱼的时间恢复。
总的来说，这种方法允许在较长时间内大量产生高质量的胚胎。
Protocol
Representative Results
Discussion
阿斯蒂安娜克斯墨西哥是一种新的生物模型，经常产卵，可以很容易地在实验室1，2繁殖。由于我们对A.墨西哥洞穴鱼进化变化的基础发展机制感兴趣，因此胚胎的产生和使用对于我们的研究目标至关重要。维持成年鱼类种群的主要目的是生产胚胎和幼鱼苗，用于发育实验和补充成人繁殖种群。有时，成人也可用于生理学、行为学或基因实?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢大卫·玛塔西安、迪德雷·海瑟、艾米·帕克赫斯特、克雷格·福特和曼迪·吴对杰弗瑞实验室 A.墨西哥 文化设施的宝贵贡献。杰弗瑞实验室的研究目前得到国家卫生研究院赠款EY024941的支持。
Materials
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
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