Changements de température progressifs pour la reproduction et le frai maximaux chez Astyanax mexicanus
Summary
Cet article décrit les conditions et les protocoles de laboratoire de base pour un régime de température incrémentale afin de stimuler le frai maximal dans le tétra mexicain Astyanax mexicanus,qui est un modèle émergent pour les études développementales et évolutives.
Abstract
Le tétra mexicain, Astyanax mexicanus, est un système modèle émergent pour les études de développement et d’évolution. L’existence de morphes de surface aux yeux (poissons de surface) et de grottes aveugles (poissons des cavernes) chez cette espèce offre l’occasion d’interroger les mécanismes sous-jacents à l’évolution morphologique et comportementale. Les poissons des cavernes ont développé de nouveaux traits constructifs et régressifs. Les changements constructifs comprennent l’augmentation des papilles gustatives et des mâchoires, des organes sensoriels de la ligne latérale et de la graisse corporelle. Les changements régressifs comprennent la perte ou la réduction des yeux. Pigmentation de mélanine, comportement scolaire, agression, et sommeil. Pour interroger expérimentalement ces changements, il est crucial d’obtenir un grand nombre d’embryons frayés. Depuis que les poissons de surface et les poissons des cavernes A. mexicanus ont été collectés au Texas et au Mexique dans les années 1990, leurs descendants ont été régulièrement stimulés à se reproduire et à frayer un grand nombre d’embryons tous les deux mois dans le laboratoire Jeffery. Bien que la reproduction soit contrôlée par l’abondance et la qualité de la nourriture, les cycles clair-foncé et la température, nous avons constaté que les changements de température progressifs jouent un rôle clé dans la stimulation du frai maximal. L’augmentation progressive de la température de 72 ° F à 78 ° F dans les trois premiers jours d’une semaine de reproduction fournit deux-trois jours de frai consécutifs avec un nombre maximal d’embryons de haute qualité, qui est ensuite suivie d’une diminution progressive de la température de 78 ° F à 72 ° F au cours des trois derniers jours de la semaine de frai. Les procédures présentées dans cette vidéo décrivent le flux de travail avant et pendant une semaine de reproduction en laboratoire pour le frai stimulé par la température incrémentielle.
Introduction
Le téléostéen Astyanax mexicanus a une forme de surface(poisson de surface) et de nombreuses formes aveugles de grottes (poissons des cavernes)1,2. Les poissons des cavernes ont évolué dans l’obscurité perpétuelle et sous des limites alimentaires, ce qui a entraîné l’apparition de nouveaux traits constructifs et régressifs3. Les traits constructifs comprennent l’augmentation des papilles gustatives et de la taille de la mâchoire, les organes sensoriels de la ligne latérale et les réserves de graisse. Les traits régressifs incluent la perte ou la réduction de la pigmentation de mélanine, des yeux, et des comportements, tels que le sommeil, l’école, et l’agression. Un attribut du système Astyanax est la fertilité complète entre les deux formes, permettant l’utilisation de la cartographie des loci de caractères quantitatifs (QTL) pour déterminer la ou les régions génomiques associées à l’évolution constructive et régressive4,5,6,7. A. mexicanus offre un système avantageux pour étudier le développement car il peut être amené à frayer fréquemment en laboratoire. Les embryons de A. mexicanus sont translucides, légèrement plus gros que ceux du poisson zèbre, produits en grande quantité et se développent en adultes sexuellement matures en environ 8 à 12 mois. Leur période de capacité de frai maximale est d’environ 5 ans. Ce protocole décrit le flux de travail nécessaire dans une installation d’élevage d’A. mexicanus au cours d’une semaine de reproduction typique et comprend les détails de l’entretien du système de pêche et du régime de contrôle de la température pour le frai maximal.
A. mexicanus est un poisson tropical qui vit dans les rivières provenant de plateaux calcaires (poissons de surface) et dans les mares dans les grottes calcaires (poissons des cavernes)8. Le calcaire se dissout pour produire de l’eau dure, et A. mexicanus prospère dans l’eau dure. Les poissons adaptés aux conditions d’eau dure peuvent tolérer une gamme de conditions salées, mais se reproduisent généralement dans des conditions spécifiques9. L’induction du comportement de frai est accomplie par une combinaison de facteurs. Parce que les poissons sont à sang froid et dépendent de leur environnement pour maintenir l’homéostasie, leur métabolisme est sensible aux changements environnementaux et ils réagissent plus rapidement aux facteurs de stress10. A. mexicanus doit être cultivé dans des systèmes aquatiques dans des conditions soigneusement réglementées d’écoulement de l’eau, de pH, de conductivité, de pression osmotique, d’éclairage et de température de l’eau.
Dans le laboratoire Jeffery, les poissons sont maintenus dans deux systèmes d’eau courante : (1) un « système pour bébés » pour les jeunes poissons adultes avant la maturité sexuelle et (2) un système adulte (ou principal) pour les adultes reproducteurs sexuellement matures. Le « système bébé » se compose de réservoirs de 8 L et 15 L alimentés en eau courante. Le « système bébé » est ensemencé par des alevins et de jeunes juvéniles métamorphosés cultivés à partir de larves dans des réservoirs plus petits (1-10 L), dans lesquels l’eau est échangée chaque semaine. Les larves, les alevins et les juvéniles sont extrêmement dépendants de la nourriture et doivent être nourris avec des aliments vivants (crevettes en saumure) une fois par jour pour assurer un taux de survie élevé. Les jeunes mineurs du « système pour bébés » sont placés dans le système pour adultes après environ 1 à 1,5 an. Au début, ils sont nourris avec des tétra flocons pulvérisés et, après une croissance ultérieure, ils sont transférés au régime alimentaire régulier des adultes. La maturité sexuelle peut être évaluée par volume abdominal chez les femelles, et les méthodes de détermination du sexe ont été décrites11. Dans le système adulte, l’eau est échangée automatiquement dans des réservoirs de 42 L 3 fois par période de 24 heures. Le système pour adultes est surveillé quotidiennement par une inspection visuelle et des lectures automatiques de température, de pH et de conductivité à partir de sondes. Le pH optimal est d’environ 7,4 et peut varier entre 6,8 et 7,5, la température de base du système est de 72/73 °F et les plages de conductivité idéales entre 600 et 800 mS. Des lectures automatiques sont affichées sur un écran de contrôleur et des vérifications visuelles de la pression de l’eau sont lues aux débitmètres répartis dans tout le système. Des vérifications indépendantes de la qualité de l’eau sont effectuées chaque semaine en testant la température et en mesurant les paramètres de qualité de l’eau pour le pH, l’ammoniac et le nitrate à l’aide d’un test colorimétrique. Les concentrations d’ammoniac et de nitrate sont maintenues à zéro ou près de zéro en ajoutant des bactéries bénéfiques (p. ex. cycle de nutafine) au système. L’éclairage de la pièce est contrôlé par une minuterie ajustée à une lumière de 14 heures et à des périodes sombres de 10 heures. En plus des paramètres globaux de qualité de l’eau mentionnés ci-dessus, les considérations suivantes nécessitent une attention particulière au cours d’une semaine de reproduction.
La première considération est la photopériode, car les poissons (même les poissons des cavernes en laboratoire) dépendent des cycles de lumière pour régler leur horloge circadienne. Les rythmes circadiens peuvent affecter tout, de la reproduction et de l’alimentation à la santé du système immunitaire12,13 et doivent être cohérents pour un maximum d’avantages pour la santé. Les poissons sont maintenus dans un système d’eau courante sur une photopériode lumineuse de 14 heures et une photopériode sombre de 10 heures. Les poissons de surface commencent généralement à frayer une heure après l’assombrissement du système, et la lumière introduite pendant cette période peut interférer avec le frai et y mettre fin. Le frai des poissons des cavernes aveugles est moins perturbé par la lumière. Par rapport au frai des poissons de surface, le frai des poissons des cavernes est retardé, commençant généralement de quatre à cinq heures après l’assombrissement du système.
La deuxième considération est la nutrition. Les poissons adultes sont normalement nourris avec un régime de tétra flocons une fois par jour. Avant le frai, les poissons sont nourris avec un régime riche en protéines complété par des quantités supplémentaires de tétra flocons et d’autres aliments: flocons de jaune d’œuf et vers noirs de Californie occasionnellement vivants (Lumbriculus variegatus) pour compenser la perte de protéines due à la production d’œufs au cours du cycle de frai précédent. Pendant la semaine de reproduction, les poissons sont nourris deux fois par jour, une fois le matin et une autre fois l’après-midi/soir. L’alimentation des poissons une seule fois par jour, mais avec une seule très grande portion de nourriture, doit être évitée, car cela peut causer de la malnutrition14.
La troisième considération est l’espace. Les besoins en espace sont basés sur la masse corporelle moyenne d’un adulte ainsi que sur des considérations comportementales, telles que le comportement de banc ou agressif du poisson. Le surpeuplement ou le sous-encombrement des réservoirs peut entraîner une agressivité accrue et un stress constant, rendant les poissons vulnérables aux blessures de leurs compagnons de réservoir et réticents à participer au frai15. Nous hébergeons généralement 10-20 poissons par réservoir de 42 L.
La quatrième considération est la température. Comme mentionné ci-dessus, les poissons sont des animaux à sang froid et dépendent de l’environnement pour maintenir la température corporelle. Parce que la température a un effet direct sur les processus métaboliques, les changements de température peuvent déclencher des altérations comportementales chez les poissons16. Ce programme de reproduction se compose de cycles de température de deux semaines: la première semaine introduit un pic de température à 78 ° F, et la semaine suivante maintient une température statique de 72 ° F. Au cours de la première semaine (de reproduction), des filets de reproduction à bords de plastique sont placés au fond des réservoirs chaque soir. Les filets de reproduction servent de barrière entre les poissons dans les bassins et les œufs frayés, qui seraient autrement consommés. La température est augmentée de 2 ° F par jour jusqu’à un maximum de 78 ° F en milieu de semaine, et le frai est induit en fonction du cycle de lumière dans les 2-3 premières soirées de cette semaine. La température est ensuite abaissée par incréments de 2 °F à 72 °F pendant les jours restants de la semaine, et la température de base est maintenue jusqu’au début de la semaine de reproduction suivante. La reproduction n’est généralement stimulée pas plus de deux fois par mois pour laisser le temps au poisson de se rétablir.
Dans l’ensemble, cette méthode permet le frai de grandes quantités d’embryons de la plus haute qualité sur une plus longue période de temps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Astyanax mexicanus est un nouveau modèle biologique qui fraie fréquemment et peut être élevé facilement en laboratoire1,2. Parce que nous nous intéressons aux mécanismes de développement qui sous-tendent les changements évolutifs chez les poissons des cavernes A. mexicanus, la production et l’utilisation d’embryons sont essentielles à nos objectifs de recherche. L’objectif principal du maintien d’un stock de poissons adultes es…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote et Mandy Ng pour leurs précieuses contributions à l’installation de culture A. mexicanus du laboratoire Jeffery. La recherche dans le laboratoire Jeffery est actuellement soutenue par la subvention EY024941 des NIH.
Materials
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
Riferimenti
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