Stegvisa temperaturförändringar för maximal avel och gytning i Astyanax mexicanus
Summary
Denna artikel beskriver de grundläggande laboratorieförhållandena och protokollen för en inkrementell temperaturregim för att stimulera maximal gytning i den mexikanska tetra Astyanax mexicanus, som är en framväxande modell för utvecklings- och evolutionära studier.
Abstract
Den mexikanska tetran Astyanax mexicanusär ett framväxande modellsystem för studier inom utveckling och evolution. Förekomsten av eyed surface (ytfisk) och blind grotta (grottfisk) morfer i denna art utgör en möjlighet att förhöra mekanismerna bakom morfologiska och beteendemässiga evolutioner. Grottfisk har utvecklat nya konstruktiva och regressiva drag. De konstruktiva förändringarna inkluderar ökningar av smaklökar och käkar, laterala linjesensoriska organ och kroppsfett. De regressiva förändringarna inkluderar förlust eller minskning av ögon. melaninpigmentering, skolbeteende, aggression och sömn. För att experimentellt förhöra dessa förändringar är det viktigt att få ett stort antal spawned embryon. Sedan den ursprungliga A. mexicanus ytfisken och grottfisken samlades in i Texas och Mexiko på 1990-talet har deras ättlingar rutinmässigt stimulerats att odla och leka ett stort antal embryon varannanmon i Jeffery-laboratoriet. Även om avel styrs av mat överflöd och kvalitet, ljus-mörka cykler och temperatur, har vi funnit att inkrementella temperaturförändringar spelar en nyckelroll för att stimulera maximal gytning. Den gradvisa temperaturökningen från 72 °F till 78 °F under de tre första dagarna av en häckningsvecka ger två-tre på varandra följande lekdagar med maximalt antal högkvalitativa embryon, som sedan följs av en gradvis temperatursänkning från 78 °F till 72 °F under de sista tre dagarna av lekveckan. De procedurer som visas i denna video beskriver arbetsflödet före och under en laboratorieuppfödningsvecka för inkrementell temperatur stimulerad gytning.
Introduction
Teleosten Astyanax mexicanus har en eyed ytbehandla-bo (ytbehandla fisken) bildar, och många olika blinda grotta-bo (grottafisk) bildar1,2. Grottfisk har utvecklats i evigt mörker och under livsmedelsbegränsningar, vilket resulterar i utseendet på nya konstruktiva och regressiva drag3. De konstruktiva egenskaperna inkluderar ökningar av smaklökar och käkstorlek, sensoriska organ i sidolinjen och fettreserver. De regressiva egenskaperna inkluderar förlust eller minskning av melaninpigmentering, ögon och beteenden, såsom sömn, skolgång och aggression. Ett attribut för Astyanax-systemet är fullständig fertilitet mellan de två formerna, vilket gör det möjligt att använda kvantitativ egenskapslokus (QTL) mappning för att bestämma de genomiska regioner som är associerade med konstruktiv och regressiv utveckling4,5,6,7. A. mexicanus erbjuder ett fördelaktigt system för att studera utveckling eftersom det kan induceras att leka ofta i laboratoriet. Embryona från A. mexicanus är genomskinliga, något större än zebrafiskar, producerade i stora mängder och utvecklas till sexuellt mogna vuxna på cirka 8-12 månader. Deras period av maximal lekkapacitet är ca 5 år. Detta protokoll beskriver arbetsflödet som behövs i en A. mexicanus kulturanläggning under en typisk avelsvecka och innehåller detaljer om fisksystemets underhåll och temperaturkontrollregimen för maximal gytning.
A. mexicanus är en tropisk fisk som lever i floder med ursprung i kalkstensplatåer (ytfisk) och i pooler i kalkstensgrottor(grottfisk) 8. Kalksten löses upp för att producera hårt vatten, och A. mexicanus trivs i hårt vatten. Fisk anpassad till hårda vattenförhållanden kan tolerera en rad salta förhållanden, men odlar i allmänhet i specifika9. Induktion av gytbeteende uppnås genom en kombination av faktorer. Eftersom fisk är kallblodig och förlitar sig på sin miljö för att upprätthålla homeostas, är deras ämnesomsättning känslig för miljöförändringar och de reagerar snabbare påstressfaktorer 10. A. mexicanus bör odlas i vattensystem under noggrant reglerade förhållanden med vattenflöde, pH, konduktivitet, osmotiskt tryck, belysning och vattentemperaturer.
I Jeffery-laboratoriet upprätthålls fisk i två rinnande vattensystem: (1) ett “babysystem” för unga vuxna fiskar före sexuell mognad och (2) ett vuxen (eller huvud) system för sexuellt mogna, avels vuxna. “Babysystemet” består av 8 L och 15 L tankar som levereras med rinnande vatten. “Babysystemet” sås av stek och unga metamorfoserade ungfåglar som odlas från larver i mindre (1-10 L) tankar, där vatten byts ut varje vecka. Larver, stek och ungfisk är extremt matberoende och måste matas levande mat (saltlakeräkor) en gång om dagen för att säkerställa en hög överlevnadsgrad. Unga ungdomar från “babysystemet” placeras i vuxensystemet efter ca 1-1,5 år. Först matas de pulveriserade tetraflingor, och efter ytterligare tillväxt överförs de till den vanliga vuxna utfodringsregimen. Sexuell mognad kan bedömas med bukvolym hos kvinnor, och metoder för att bestämma kön har beskrivits11. I vuxensystemet byts vatten ut automatiskt i 42 L tankar 3 gånger per 24-timmarsperiod. Vuxensystemet övervakas dagligen genom visuell inspektion och automatiska temperatur-, pH- och konduktivitetsavläsningar från sonder. Det optimala pH-talet är cirka 7,4 och kan variera mellan 6,8-7,5, systemets bastemperatur är 72/73 °F och den ideala ledningsförmågan varierar mellan 600-800 mS. Automatiska avläsningar visas på en styrenhetsskärm och visuella kontroller av vattentrycket avläses vid flödesmätare fördelade över hela systemet. Oberoende kontroller av vattenkvaliteten görs varje vecka genom att testa temperaturen och mäta vattenkvalitetsparametrar för pH, ammoniak och nitrat med hjälp av ett kolorimetriskt test. Ammoniak- och nitratnivåerna hålls på eller nära noll genom att tillsätta nyttiga bakterier (t.ex. Nutafin Cycle) till systemet. Rumsbelysningen styrs av en timer som är justerad till 14-timmars ljus och 10 timmars mörka perioder. Förutom de övergripande vattenkvalitetsparametrarna som nämns ovan behöver följande överväganden särskild uppmärksamhet under en avelsvecka.
Det första övervägandet är fotoperiod, eftersom fisk (även grottfisk i laboratoriet) är beroende av ljuscykler för att ställa in sin dygnsrytmklocka. Dygnsrytmen kan påverka allt från avel och utfodring till immunsystemets hälsa12,13 och måste vara konsekvent för maximala hälsofördelar. Fisk hålls i ett rinnande vattensystem på en 14-timmars ljus och 10-timmars mörk fotoperiod. Ytfisken börjar i allmänhet leka en timme efter att systemet har mörkats, och ljus som introduceras under denna period kan störa och avsluta gytning. Gytningen av blind grottfisk störs mindre av ljus. Jämfört med ytfisklekning fördröjs grottfiskens gytning, vanligtvis med början fyra till fem timmar efter att systemet har mörkats.
Det andra övervägandet är näring. Vuxna fiskar matas normalt en diet av tetraflingor en gång om dagen. Före gytning matas fisk en proteinrik kost kompletterad med extra mängder tetraflingor och annan mat: äggulaflingor och ibland levande Kalifornien blackworms (Lumbriculus variegatus) för att kompensera för proteinförlust på grund av äggproduktion under föregående gytcykel. Under uppfödningsveckan matas fisken två gånger per dag, en gång på morgonen och igen på eftermiddagen /kvällen. Fiskfoder endast en gång om dagen men med en enda mycket stor del av maten bör undvikas, eftersom detta kan orsaka undernäring14.
Den tredje faktorn är rymden. Utrymmeskraven baseras på den genomsnittliga kroppsmassan hos en vuxen samt beteendemässiga överväganden, till exempel om fisken har skolbeteende eller aggressivt beteende. Över- eller underträngningstankar kan leda till ökad aggression och konstant stress, vilket gör fisken sårbar för skador från sina tankkamrater och motvillig att delta igytning 15. Vi brukar hysa 10-20 fiskar per 42 L tank.
Det fjärde övervägandet är temperatur. Som nämnts ovan är fisk kallblodiga djur och förlitar sig på miljön för att bibehålla kroppstemperaturen. Eftersom temperaturen har en direkt effekt på metaboliska processer kan temperaturförändringar utlösa beteendeförändringar hos fisk16. Detta avelsprogram består av två veckors temperaturcykler: den första veckan introducerar en temperaturökning till 78 °F, och nästa vecka bibehåller en statisk temperatur på 72 °F. Under den första (avels)veckan placeras plastkantade avelsnät i botten av tankarna varje kväll. Avelsnäten fungerar som en barriär mellan fisken i tankarna och de lekta äggen, som annars skulle konsumeras. Temperaturen höjs med 2 °F per dag till högst 78 °F i mitten av veckan, och gytning induceras enligt ljuscykeln under de första 2-3 kvällarna denna vecka. Temperaturen sänks sedan med 2 °F steg till 72 °F under de återstående dagarna i veckan, och bastemperaturen bibehålls fram till början av nästa avelsvecka. Avel stimuleras vanligtvis inte mer än två gånger i månaden för att ge fisken tid att återhämta sig.
Sammantaget möjliggör denna metod gytning av stora mängder embryon av högsta kvalitet under en längre tid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Astyanax mexicanus är en ny biologisk modell som leker ofta och kan odlas lätt i laboratoriet1,2. Eftersom vi är intresserade av de utvecklingsmekanismer som ligger till grund för evolutionära förändringar i A. mexicanus grottfisk, är produktion och användning av embryon avgörande för våra forskningsmål. Det främsta syftet med att upprätthålla ett vuxenbestånd av fisk är produktion av embryon och ungt stek för användning i ut…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote och Mandy Ng för värdefulla bidrag till Jeffery-laboratoriet A. mexicanus kulturanläggning. Forskningen i Jeffery-laboratoriet stöds för närvarande av NIH-bidraget EY024941.
Materials
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
Riferimenti
- Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. Biologia dello sviluppo. 231, 1-12 (2001).
- Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
- Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
- O’Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281 (2013).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15 (2015).
- Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1 (2018).
- Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
- Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62 (2019).
- Borowsky, R. . Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , (2008).
- Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112 (2015).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
- Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34 (2009).
- Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
- Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025 (2019).
- Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
- Borowsky, R. . In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , (2008).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591 (2019).
- Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
- Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28 (2014).
- Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487 (2017).
- Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370 (2015).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Biologia dello sviluppo. 441, 313-318 (2018).
