Questo protocollo fornisce strumenti sperimentali in vitro per valutare la trasformazione delle cellule mammarie umane. Vengono descritti i passaggi dettagliati per seguire il tasso di proliferazione cellulare, la capacità di crescita indipendente dall'ancoraggio e la distribuzione di lignaggi cellulari in colture 3D con matrice di membrana basale.
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Articolo metodologico
Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tumorigenesi è un processo in più fasi in cui le cellule acquisiscono capacità che consentono la loro crescita, sopravvivenza e diffusione in condizioni ostili. Diversi test cercano di identificare e quantificare questi tratti distintivi delle cellule cancerose; tuttavia, spesso si concentrano su un singolo aspetto della trasformazione cellulare e, di fatto, sono necessari più test per la loro corretta caratterizzazione. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire ai ricercatori una serie di strumenti per valutare la trasformazione cellulare in vitro da un'ampia prospettiva, consentendo così di trarre conclusioni valide.
Un'attivazione prolungata della segnalazione proliferativa è la caratteristica principale dei tessuti tumorali e può essere facilmente monitorata in condizioni in vitro calcolando il numero di raddoppi della popolazione raggiunti nel tempo. Inoltre, la crescita delle cellule nelle colture 3D consente la loro interazione con le cellule circostanti, simile a ciò che accade in vivo. Ciò consente la valutazione dell'aggregazione cellulare e, insieme all'etichettatura immunofluorescente di marcatori cellulari distintivi, di ottenere informazioni su un'altra caratteristica rilevante della trasformazione tumorale: la perdita di una corretta organizzazione. Un'altra caratteristica notevole delle cellule trasformate è la loro capacità di crescere senza attaccamento ad altre cellule e alla matrice extracellulare, che può essere valutata con il saggio di ancoraggio.
Vengono fornite procedure sperimentali dettagliate per valutare il tasso di crescita cellulare, per eseguire l'etichettatura immunofluorescente dei marcatori di lignaggio cellulare nelle colture 3D e per testare la crescita delle cellule indipendenti dall'ancoraggio nell'agar morbido. Queste metodologie sono ottimizzate per le cellule epiteliali primarie del seno (BPEC) a causa della sua rilevanza nel cancro al seno; tuttavia, le procedure possono essere applicate ad altri tipi di celle dopo alcune regolazioni.
Introduzione
Sono necessari più eventi successivi per lo sviluppo della neoplasia. Nel 2011, Hanahan e Weinberg hanno descritto 10 capacità che consentono la crescita, la sopravvivenza e la diffusione delle cellule trasformate: i cosiddetti "Hallmarks of Cancer"1. La metodologia qui descritta compila tre diversi strumenti per valutare la trasformazione cellulare in vitro concentrandosi su alcune delle caratteristiche distintive delle cellule tumorali. Queste tecniche valutano il tasso di proliferazione cellulare, il comportamento delle cellule quando coltivate in 3D e la loro capacità di formare colonie con indipendenza di ancoraggio.
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Protocollo
Campioni umani utilizzati nei seguenti esperimenti sono stati ottenuti da mammoplastiche di riduzione effettuate a Clínica Pilar Sant Jordi (Barcellona) con il consenso di procedura standard. Tutte le procedure sono eseguite in un armadio di sicurezza biologica di classe II, salvo diversa indicazione.
1. Coltura in vitro di cellule epiteliali mammarie umane e accumulo della trama della curva di crescita
-
Coltura in vitro di cellule epiteliali primarie del seno (BPCC): passaging cellulare
NOTA: Per la derivazione del BPEC e la coltura cellulare seguire le istruzioni descritte da Ince et al., 2007
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Risultati
Un modello sperimentale di trasformazione cellulare con l'introduzione di tre elementi genetici nei BPEC è stato scelto per generare risultati rappresentativi della trasformazione oncogenica6,7 (Figura 3). I BPEC non trasformati(N)sono stati derivati da tessuti mammari indenne da malattie come descritto dall'Incee dai colleghi 6 e coltivati secondo il protocollo qui indicato. Dopo ave.......
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Discussione
I protocolli sperimentali descritti in questo documento forniscono strumenti utili per valutare la trasformazione oncogenica delle cellule coltivate in vitro. Ogni tecnica valuta aspetti specifici del processo di trasformazione e, pertanto, occorre prestare particolare attenzione quando si vengono tratte conclusioni da una singola analisi. L'accumulo di curve di crescita è un approccio che richiede informazioni già disponibili quando si coltivano cellule per altri scopi. Ciò rende questa tecnica più economica e più facil.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il laboratorio AG è finanziato dal Consiglio spagnolo per la sicurezza nucleare. T.A. e A.G. sono membri di un gruppo di ricerca riconosciuto dalla Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT ha un contratto finanziato dalla Fondazione Scientifica Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. Il contratto G.F. è finanziato da una sovvenzione della Fondazione Cellex.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 ml di pipette sierologiche | Labclinics | PLC91001 | |
| 1,5 ml di Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Gli eppendorf scuri sono preferiti per la conservazione a lungo termine MTT |
| 10 μ l Puntali per pipette senza filtro | Biologix | 20-0010 | |
| in vetro da 100 ml | Con tappo, autoclavabile | ||
| 1000 μ l Puntali per pipette con filtro | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μ l Puntali per pipette senza filtro | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Provette coniche | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Pipette sierologiche | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μ l Puntali per pipette con filtro | Labclinics | FTR200-96 | |
| Pipette sierologiche da 5 ml | Labclinics | PLC91005 | |
| Provette coniche da 50 ml | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Utilizzato per la fissazione della struttura 3D prima della marcatura con immunofluorescenza |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Utilizzato per il test di ancoraggio |
| Anticorpo anti-Claudina 4 | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Diluizione di lavoro 1:100, ospite: coniglio |
| Anti-Citocheratina 14 [RCK107] anticorpo | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Diluizione di lavoro 1:100, ospite: topo |
| Anti-topo Anti-cianonina Cy3 anticorpo | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Diluizione di lavoro 1:500, ospite: capra |
| Anti-coniglio Alexa Fluor 488 anticorpo | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Diluizione di lavoro 1:500, ospite: |
| autoclave | |||
| di capra BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Coltura cellulare a 24 pozzetti Plate | Labclinics | PLC30024 | Utilizzato per le colture 3D in Matrigel. Coltura cellulare a fondo piatto |
| 6 pozzetti | Plate Labclinics | PLC30006 | Utilizzato per il saggio di ancoraggio |
| Incubatore cellulare (37 º C e 5 % CO2) | |||
| Filtri cellulari | Fisherbrand | 11587522 | Dimensioni della maglia: 40 μ m |
| Software CellSense | Olympus | Utilizzato per l'acquisizione di immagini | |
| Centrifuga | |||
| Colera Tossina da Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Utilizzato per integrare il terreno di coltura cellulare |
| Cabina di sicurezza biologica di classe II | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Microscopio confocale invertito | Leica | TCS SP5 | |
| Occhiali di copertura | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, spessore 0,13 - 0,17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinofenil)-1H -indolo-6-carbossamidina | ||
| Fetale Siero bovino Biowest | S1810 | Utilizzato per inattivare l'azione della tripsina | |
| Software Fiji (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Download gratuito, nessuna licenza necessaria |
| Pipette in vetro Pasteur Vetrini | |||
| Fisherbrand | 11844782 | ||
| Siero di capra | Biowest | S2000 | Utilizzato per l'immunofluorescenza di strutture 3D |
| Guanti | Utilizzato per la manipolazione dell'agar dopo l'autoclave | ||
| Bagno riscaldante (37 º C) | Utilizzato per temperare le soluzioni prima della subcoltura cellulare | ||
| Bagno riscaldante (42 º C) | Utilizzato per mantenere caldo l'agar | ||
| Piastra | Utilizzato per la disidratazione del Matrigel | ||
| Camera umida | Utilizzato per l'incubazione degli anticorpi durante l'immunofluorescenza | ||
| Ghiaccio | Utilizzato durante la manipolazione del Matrigel | ||
| Ghiacciaia | |||
| Microscopio ottico invertito | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | negozio a -20 º C e mantenere il freddo durante l'uso. Indicato come matrice della membrana basale |
| Metanolo | PanReac AppliChem | 131091 | Utilizzato per la fissazione 3D della struttura prima della marcatura immunofluorescente |
| Micropipetta | p1000, p200 e p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Utilizzato per calcolare il raddoppio della popolazione e per ottenere l'equazione del tasso di crescita |
| MilliQ acqua | Indicato come acqua ultrapura | ||
| unghie | Utilizzato per sigillare i campioni dopo il montaggio | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Utilizzato per coprire la soluzione anticorpale durante l'incubazione |
| PBS pH 7.4 (senza calcio e magnesio) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Utilizzato per la subcoltura cellulare |
| Compresse PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Diluire in acqua milliQ. Non è richiesta alcuna sterilità. Utilizzato per l'immunofluorescenza |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 fiasche | Corning | 353808 | Utilizzato per la coltura BPEC |
| Scettro Contatore cellulare automatizzato | Millipore | PHCC20060 | In alternativa, utilizzare un emocitometro |
| Forbici | Utilizzato per tagliare i puntali delle pipette e il parafilm | ||
| Filtri sterili 0,22 &; m | Millipore | SLGP033RS | Utilizzato per filtrare la soluzione MTT |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Conservare a -20 º C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Utilizzato per l'immunofluorescenza di strutture 3D |
| Tripsina-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Diluire in PBS per ottenere la soluzione 3X |
| Vectashield Antifade Mounting Medium Vector | Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture | Medium Stemgent | 00-0051 | Utilizzato per la coltura primaria di BPIC |
| WIT-T Terreno di coltura | Stemgent | 00-0047 | Utilizzato per la coltura BPEC trasformata |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 ....
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Ristampe e permessi
