Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) gir en kraftig plattform for bakteriestudier, noe som gjør det mulig å oppnå nanoskala oppløsning. Begge deler, kartlegging av subcellulære endringer (f.eks. ved celledeling) samt komparative studier av kjemisk sammensetning (f.eks. som følge av legemiddelresistens) kan utføres på et enkelt cellenivå i bakterier.
Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) er en ny kombinatorisk teknikk som muliggjør samtidig karakterisering av fysiske egenskaper og kjemisk sammensetning av prøven med nanoskala oppløsning. Ved å kombinere AFM med IR, overvinnes den romlige oppløsningsbegrensningen til konvensjonell IR, slik at en oppløsning på 20-100 nm kan oppnås. Dette åpner døren for et bredt spekter av nye anvendelser av IR mot å undersøke prøver mindre enn flere mikrometer, tidligere uoppnåelige ved hjelp av konvensjonell IR-mikroskopi. AFM-IR er eminent egnet for bakterieforskning, og gir både spektral og romlig informasjon på enkeltcellet og intracellulært nivå. De økende globale helseproblemene og ugunstige fremtidige spådommer om bakterielle infeksjoner, og spesielt rask utvikling av antimikrobiell resistens, har skapt et presserende behov for et forskningsverktøy som er i stand til fenotypisk probing på enkeltcellet og subcellulært nivå. AFM-IR tilbyr potensialet til å møte dette behovet, ved å muliggjøre detaljkarakterisering av kjemisk sammensetning av en enkelt bakterie. Her gir vi en komplett protokoll for prøvepreparering og datainnsamling av enkeltspektra og kartlegging av modalitet, for anvendelse av AFM-IR mot bakteriestudier.
Bakterier er encellede prokaryote organismer, som forekommer i forskjellige former og størrelser, vanligvis i området flere hundre nanometer til mikrometer. De eksisterer i en rekke habitater og er avgjørende for livets eksistens. Innenfor menneskekroppen er flertallet av bakteriene som er tilstede i tarmen ufarlige, og mange er faktisk gunstige1. Imidlertid er flere bakteriearter patogene og forårsaker en rekke smittsomme sykdommer. Bakterielle infeksjoner kan føre til utvikling av sepsis og septisk sjokk: en livstruende tilstand, som følge av kroppens respons på en infeksjon2. Sepsis er en global stor helsetrussel, med høy utbredelse over hele verden og alvorlig dødelighet. Bare i 2017 ble det registrert anslagsvis 50 millioner tilfeller av sepsis over hele verden, med 11 millioner av dem som resulterte i død (ca. 20%)2. Videre ble en nedgang i pasientens overlevelsessjanser, på grunn av forsinket behandling, vist å forekomme på en timebasert måte3,4.
Bakterielle infeksjoner behandles med antibiotika. Alvorlighetsgraden av potensielle konsekvenser av bakterielle blodstrømsinfeksjoner (BSIer), sammen med en klar betydning av rask initiering av antimikrobiell terapi, forårsaker behovet for umiddelbar antibiotikaadministrasjon. Men ettersom de nåværende diagnostiske tilnærmingene som brukes i klinisk praksis (f.eks. blodkulturering) krever relativt lang tid, oppstår antibiotikaadministrasjon ofte før positiv BSI-diagnose5. Denne faktoren fører til omfattende overforbruk av antibiotika, som sammen med overdreven antibiotikabruk i andre sektorer som landbruket – skaper et alvorlig evolusjonært press mot utviklingen av antimikrobiell resistens (AMR)6,7. AMR er for tiden et av de mest presserende globale helseproblemene7,8 og, innen 2050, er spådd å bli den ledende dødsårsaken9. Utviklingen av motstand, sammen med spredning av AMR-stammer, forekommer i et alarmerende tempo7,8,9 og overstiger, langt, graden av oppdagelse av nye antibiotika10. Nye resistente fenotyper dukker kontinuerlig opp over hele verden, mens
forskning dedikert til å forstå AMR-relaterte endringer er ofte treg og begrenset av tilgjengelige tilnærminger11. I tillegg fokuserer de ofte brukte metodene, som polymerasekjedereaksjon (PCR) og hele gensekvensering (WGS), bare på genotypiske endringer. Disse er ikke tilstrekkelige til å avsløre motstandsmekanismene11, noe som gir et presserende behov for et forskningsverktøy som gjør det mulig å forstå bakteriens kjemiske sammensetning.
Infrarød spektroskopi (IR) gir en molekylær karakterisering av prøven og er dermed en lovende kandidat for fenotypisk bakterieprobing. Siden de tidlige applikasjonene12, ble det demonstrert en stor størrelse på eksempler på bruken i litteraturen13,14. Disse inkluderer fenotypisk basert identifikasjon av bakterier på slekt15, art16og stamme17,18 nivå. Den romlige oppløsningen til konvensjonell IR er imidlertid begrenset til flere mikroner på grunn av bølgelengdediffraksjonens romlige oppløsningsgrense19. Siden størrelsen på de fleste bakterier ligger under denne grensen (f.eks. Staphylococcus aureus ≈ 400 nm i diameter), er konvensjonell IR ikke aktuelt for probing på encellet eller intracellulært nivå.
Den romlige oppløsningsbegrensningen ble nylig overvunnet ved å kombinere IR-spektroskopi med Atomic Force Microscopy (AFM-IR). I dette tilfellet oppdages IR-absorpsjonen indirekte, gjennom termisk utvidelse av materialet19,20,21,22. Kort sagt resulterer absorpsjonen av IR-stråling i en lokal temperaturøkning. Dette kan måles enten direkte23 eller gjennom måling av oscillasjon av AFM cantilever-sonden, som følge av kraftimpuls opprettet ved IR-absorpsjon20,21. Den kombinatoriske AFM-IR-teknikken gjør det mulig å oppnå romlig oppløsning som nærmer seg 20 nm, og gir samtidig informasjon om lokale fysiske egenskaper til en prøve (AFM) og dens kjemiske sammensetning (AFM-IR). Innsamling av begge deler, enkeltspektra fra utvalgte flekker og kartlegging av intensiteten til valgte bølgenummerverdier innenfor et valgt område er mulig.
Tatt i betraktning den oppnåelige romlige oppløsningen til AFM-IR, er det tydelig at teknikken åpner muligheten for kjemisk / fenotypisk probing av enkeltbakteriecelle og deres intracellulæresammensetning 24. Hittil ble flere eksempler på anvendelsen av AFM-IR for enkeltbakterier demonstrert i litteraturen19,20,21,22,25,26,27,28. Disse omfatter enkeltspektralanalyse19,21,22 og tilordning på undercellenivå19,22,25,26,27,28. For eksempel er evnen til å oppdage intracellulære lipid vesicles27 og virus28 innenfor en enkelt bakterie blitt beskrevet. Disse resultatene viser nytten av AFM-IR for nanoskalastudier av enkeltbakterier og klinisk relevante patogener19.
Derfor presenterer vi en prøvepreparerings- og innsamlingsmetode for AFM-IR-data av flerlags-, monolags- og enkeltcellebakterielle prøver. Protokollen beskrevet her ble brukt til å studere forskjellige arter av bakterier22 og endringene i deres kjemiske sammensetning. Spesielt ble in vivo-utviklingen av vancomycinresistens og daptomycin ikke-følsomhet undersøkt i kliniske par S. aureus19. Begge deler oppstod vancomycin intermitterende resistens og daptomycin ikke-følsomhet i S. aureus (VISA og DpR) relativt nylig, etter økt bruk og innføring av disse antibiotika til klinikker, som utgjør et betydelig medisinsk problem. Spesielt mekanismen for daptomycin ikke-mottakelighet forblir fortsatt unnvikende, noe som hindrer alternativ narkotikautvikling19,29. Den presenterte protokollen fokuserer på levering av pålitelig AFM-IR-spektra av enkeltbakterier, som videre kan analyseres ved hjelp av en rekke kjemometriske tilnærminger, i henhold til eksperimentelle mål. Det inkluderer i tillegg kartleggingsmetoden, som gjelder for intra-cellulære studier.
Nytten av IR-spektroskopi for karakterisering av et bredt spekter av biologiske prøver i sammenheng med deres kjemiske sammensetning er godt etablert. I løpet av det siste tiåret har IR-spektroskopi dukket opp som et lovende verktøy for bakteriestudier12,13,14,15,16,17. Det fortsetter å tiltrekke seg betydelig interesse for mikrobiologi, som en av de få teknikkene som muliggjør fenotypisk karakterisering gjennom kjemisk sammensetning. I denne sammenhengen ligger den største ulempen ved konvensjonell FTIR-mikroskopi i begrenset romlig oppløsning, og forhindrer enkeltcelle- og subcellulære studier av bakterier. Faktisk representerer den lille størrelsen på bakterier en hindring, ikke bare for IR, men for de aller fleste teknikker. Dermed er de tilgjengelige forskningsverktøyene for enkeltcelle- og subcellulære studier av bakterier betydelig begrenset. Kombinasjonen av AFM med IR gjør det mulig å overvinne den romlige oppløsningsbegrensningen av IR-spektroskopi, og gir et nytt verktøy for bakteriell forskning, som er i stand til nanoskala probing av kjemisk sammensetning.
Teknikken er ikke begrenset til enkeltcellestudier og gjør det mulig for en å sondere en rekke prøver, alt i tykkelse. Utvilsomt er ren og forsiktig prøveforberedelse avgjørende for å oppnå bilder av høy kvalitet. Protokollen heri gir en metode for å forberede flerlags-, monolags- og/eller encellede prøver av ulike bakterier (figur 1). Den forberedte prøven avhenger av flere faktorer, inkludert den første bakteriebelastningen, ettervaskfortynning samt ytterligere fortynning på substratet. Mengden prøve oppnådd etter fortynning av de vaskede pelletsene og før avsetning på substratet tillater vanligvis fremstilling av mange prøver. Derfor, for å oppnå ønsket fordeling av prøven på substratet, er det ofte gunstig å forberede en rekke prøver, alt i fortynning. For studier som tar sikte på innsamling av AFM-IR-spektra i stedet for subcellulær avbildning, kan det være gunstig å endre mengden prøve (f.eks. fra monolayer til flerlags) for å øke intensiteten av signalet.
Et annet kritisk aspekt ved prøvepreparering er riktig fjerning av middels rester. Avhengig av de valgte prøvekulturmetodene, samles prøven enten fra flytende medium eller fra en agarplate. I begge tilfeller er det sannsynlig at middels rest vil være til stede i prøven, men i mye mindre grad ved innsamling fra agarplater. Siden bakterievekstmedier inneholder en overflod av ulike biologiske komponenter, er det viktig å sikre riktig fjerning av medium. Vi anbefaler tre vasker med ultrarent vann til agarplateprøver og minst fire vasker for prøver samlet inn fra medium. Antall vasker kan økes, om nødvendig; For sammenligning mellom ulike prøver er det imidlertid viktig å holde det konsistent mellom prøver. Den demonstrerte protokollen bruker vann, i stedet for løsemidler som fosfatbufferløsning (PBS) eller saltvann. Både PBS og saltvann fører til dannelse av krystaller ved lufttørking, noe som kan skade bakteriene. I tillegg er begge en kilde til intense IR-bånd, spesielt med PBS, som inneholder flere bånd i fingeravtrykksregionen. Mangelen på evne til bruk av saltvann eller PBS, representerer for tiden en viktig begrensning for teknikken. Vanligvis forårsaker bruk av vann til vask ingen ødeleggende påvirkning på bakteriene; Forsiktighet bør imidlertid utvises, og om mulig bør eksponeringstiden for vann begrenses. Hvis prøveforberedelsesprotokollen må pauses på vaskestadiet, anbefales det å forlate prøven i pelletert form etter fjerning av vannet. Dette er spesielt viktig for Gram-negative bakterier, som inneholder en tynnere cellevegg, da de er mer utsatt for brudd.
For å sikre riktige AFM-IR-data av høy kvalitet er flere aspekter i datainnsamlingsprotokollen av avgjørende betydning. For det første er riktig innsamling av bakgrunn avgjørende for datainnsamling. Spesielt er vedlikehold av stabile fuktighetsnivåer gjennom bakgrunnsinnsamling samt mellom bakgrunn og prøveinnsamling nødvendig. For å sikre dette anbefaler vi å rense instrumentet med nitrogen og opprettholde fuktighetsnivåene ikke høyere enn 25%. Mangel på rensing kan pålegge en betydelig begrensning, spesielt på steder med høy luftfuktighet. For det andre bør viktigheten av riktig optimalisering av IR-flekker utheves. For best resultat kan en forkunnskap om posisjonen til band maxima være gunstig. For eksempel kan et konvensjonelt IR-spekter av bakteriell pellet brukes til å bestemme stillinger av bånd som forventes fra en prøve. Hvis det ikke er mulig å skaffe seg, som en alternativ tilnærming, kan brukeren bruke IR-spektra tilgjengelig i litteraturen eller begynne optimaliseringen ved hjelp av en båndposisjon som er rimelig å forvente i bakterien (f.eks. midt i I og amide II). For det tredje, for datainnsamling, er det viktig å fremheve betydningen av forsiktig kraftvalg (slik at man kan oppnå et godt S / N-forhold), da det kan ha en ødeleggende effekt. Den anbefalte effekten avhenger av tykkelsen på prøven, med grov veiledning tilgjengelig i instrumenthåndboken31. Vi anbefaler å empirisk teste tilstanden til prøven etter måling ved innsamling av et AFM-bilde, da det vil avsløre enhver ødeleggende innflytelse. Videre fungerer samlingen av AFM-bilder fra samme område før og etter innsamling av AFM-IR-spektra som en god bekreftelse på at ingen drift har skjedd, og spektraet stammer faktisk fra det valgte punktet i cellen. Muligheten for drift er spesielt viktig når du bruker bildemodaliteten, gjennom påfølgende avbildning av IR-intensitet ved utvalgte bølgenummerverdier. Et eksempel på dette er illustrert i Figur 5. Bildeområdet ble definert i begynnelsen av eksperimentet og er ment å være konsekvent for alle bølgenummerverdier. En klar drift er imidlertid synlig mellom hvert AFM-høydebilde (og det tilsvarende IR-bølgenummerintensitetsbildet), med anskaffelsestid for hvert kart på ca. 40 min. På grunn av dette, for brukere som samler inn bildedata, anbefaler vi at du alltid velger et område som er litt større enn utvalget av interesse, for å sikre at selv ved eksistens av drift, vil utvalget av interesse forbli innenfor det avbildede området.
De potensielle begrensningene i protokollen inkluderer mangelen på evne til å samle inn data i en hydrert tilstand i fysiologiske løsninger (f.eks. saltvann eller PBS) beskrevet ovenfor. Videre, spesielt i områder med høy luftfuktighet, er det ofte behov for nitrogenrensing. Videre gjør protokollen det mulig å sondere organismer ned til 100 nm i størrelse, unntatt muligheten for bruk for mindre strukturer. Selv om dette kan overvinnes ved hjelp av en annen laser (f.eks. kvantekaskadelaser som gjør det mulig å oppnå den romlige oppløsningen på 20 nm), er den også forbundet med begrenset spektral rekkevidde samt vanskeligheter med å oppnå et godt signal-til-støy-forhold. Til slutt kan probing av myke overflater utgjøre en utfordring med spissen som ikke oppdager overflaten riktig og fortsetter utover kontaktpunktet, til brudd. Selv om dette vanligvis ikke er et problem med bakterieprøver, kan det oppstå ved målinger av mykere prøver. I slike tilfeller anbefales det å forsøke å engasjere seg på ren overflate av substratet i nærheten av prøven.
Den beskrevne protokollen kan brukes til en rekke typer bakterieforskning, inkludert komparative studier mellom ulike prøver samt subcellulær undersøkelse. Dataene kan analyseres ved hjelp av kjemometriske tilnærminger for enkeltspektra og avbildningsmodaliteter35, avhengig av målet med forskningen. Videre kan protokollen også endres for påføring til annet biologisk materiale (som sopp, gjær, celler, etc.), gjennom tilsetning av fiksering.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne anerkjenne Bruker for deres støtte. Dette arbeidet ble støttet av Monash University Advancing Women’s Success Grant (K. Kochan). A.Y.P anerkjenner støtte fra australian National Health and Medical Research Council Practitioner Fellowship (APP1117940). Dette arbeidet ble finansiert av australian Research Council Discovery Project DP180103484. Vi vil takke Mr. Finlay Shanks for hans instrumentale støtte og Ms. Xenia Kostoulias for hennes tekniske hjelp med prøvene.
AFM metal specimen disc | PST ProSciTech Pty Ltd | GA530-15 | Recommended 15 mm |
Anasys AFM-IR nanoIR2 | Anaysys Instruments | 0 | model: nanoIR2 |
Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2 | Bruker / Anasys Instruments | – | Model: Model: PR-EX-NIR2 |
Heraeus Pico 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | – | – |
Matlab | Mathworks Inc | – | Multivariate data analysis software |
Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL | Heathrow Scientific | HEA4323 | Can be replaced with any other micro-centrifuge tube |
NanoIR 2 instrument | Bruker / Anasys Instruments | – | – |
PLS toolbox | Mathworks Inc | – | GUI for Matlab |
Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates) | Thermo Fisher | PP2001 | Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment |
Selected bacterial strain | – | – | The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.) |
Substrate (e.g. Raman grade CaF2) | Crystran | CAFP13-2R | Recommended size: 13 mm Ø x 2.0 mm |
Tip pipette 1000 µl | Axygen | T-1000-B | – |
Tip pipette 200 µl | Axygen | T-200-C | – |
Tip pipette 0.5-10 µl | Axygen | T-300-R | – |
Ultrapure water | – | – | – |