La tecnologia MAPS è stata sviluppata per esaminare il targetome di uno specifico RNA normativo in vivo. L'sRNA di interesse è contrassegnato con un aptamer MS2 che consente la co-purificazione dei suoi partner di RNA e la loro identificazione tramite sequenziamento dell'RNA. Questo protocollo modificato è particolarmente adatto per i batteri Gram-positivi.
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Articolo metodologico
Purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con sequenziamento dell'RNA nei batteri gram-positivi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sebbene i piccoli RNA regolatori (sRNA) siano diffusi tra il dominio batterico della vita, le funzioni di molti di loro rimangono scarsamente caratterizzate in particolare a causa della difficoltà di identificare i loro obiettivi di mRNA. Qui, abbiamo descritto un protocollo modificato della purificazione ms2-affinity accoppiato con la tecnologia RNA Sequencing (MAPS), con l'obiettivo di rivelare tutti i partner RNA di uno specifico sRNA in vivo. In generale, l'aptamero MS2 è fuso all'estremità 5 ' dell'sRNA di interesse. Questo costrutto viene quindi espresso in vivo, permettendo all'MS2-sRNA di interagire con i suoi partner cellulari. Dopo la raccolta batterica, le cellule vengono leccate meccanicamente. L'estratto grezzo viene caricato in una colonna cromatografica a base di amilosio precedentemente rivestita con la proteina MS2 fusa alla proteina legante del maltosio. Ciò consente l'acquisizione specifica di MS2-sRNA e RNA interagenti. Dopo l'eluizione, gli RNA co-purificati sono identificati dal sequenziamento dell'RNA ad alta produttività e dalla successiva analisi bioinformatica. Il seguente protocollo è stato implementato nell'agente patogeno umano Gram-positivo Staphylococcus aureus ed è, in linea di principio, trasponibile a qualsiasi batterio Gram-positivo. In sintesi, la tecnologia MAPS costituisce un metodo efficiente per esplorare a fondo la rete normativa di un particolare sRNA, offrendo un'istantanea dell'intero targetome. Tuttavia, è importante tenere presente che gli obiettivi putativi identificati da MAPS devono ancora essere convalidati da approcci sperimentali complementari.
Introduzione
Centinaia, forse anche migliaia di piccoli RNA (SRNA) normativi sono stati identificati nella maggior parte dei genomi batterici, ma le funzioni della stragrande maggioranza di essi rimangono insolito. Nel complesso, gli sRNA sono molecole brevi e non codificanti, che svolgono ruoli importanti nella fisiologia batterica e nell'adattamento agli ambientifluttuanti1,2,3. Infatti, queste macromolecole sono al centro di numerose reti normative complesse, che hanno un impatto sulle vie metaboliche, sulle risposte allo stress ma anche sulla virulenza e sulla resistenza agli antibiot....
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Protocollo
1. Buffer e supporti
- Per gli esperimenti MAPS, preparare i seguenti buffer e supporti:
- Tampone A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT)
- Tampone E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltosio, 0,1% Tritone, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT)
- Tampone di carico dell'RNA (0,025% cianolo di xilene e 0,025% blu bromofenolo in urea 8 M)
- Mezzo per infusione di cuore cerebrale (BHI) (12,5 g di cervello di vitello, 10 g di peptone, 5 g di cuore di manzo, 5 g di NaCl, 2,5 g di Na2HPO4 e 2 g di glucosio per 1 L)
- Lysogeny Broth (LB) medium (10 g di peptone, 5 g di estratto di ....
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Risultati
I risultati rappresentativi derivano dallo studio del targetome RsaC in S. aureus29. RsaC è uno sRNA non convenzionale lungo 1.116 nt. La sua estremità di 5' contiene diverse regioni ripetute mentre la sua estremità di 3 ' (544 nt) è strutturalmente indipendente e contiene tutti i siti di interazione previsti con i suoi obiettivi di mRNA. L'espressione di questo sRNA è indotta quando il manganese (Mn) è scarso, che si incontra spesso nel contesto della risposta immunitaria dell'ospite. Ut.......
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Discussione
Un protocollo modificato per i batteri Gram-positivi
Il protocollo iniziale di MAPS è stato sviluppato per studiare l'interactoma dello sRNA nell'organismo modello E. coli20,30. Qui descriviamo un protocollo modificato adatto alla caratterizzazione di reti regolatorie dipendenti dall'sRNA nell'opportunistico agente patogeno umano S. aureus ed è certamente trasponibile ad altri batteri Gram-positivi, patogeni o meno.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH e ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, a PR). È stato anche pubblicato nell'ambito del labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 e di ANR-17-EURE- 0023 (a PR), come finanziamento dallo Stato gestito da ANR nell'ambito degli investimenti per il futuro programma. DL è stato supportato dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 753137-SaRNAReg. Il lavoro in E. Massé Lab è stato supportato da sovvenzioni operative del Canadian Institutes of Health Research (CIHR), del Natural Scienc....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Provette per centrifuga da 15 mL | Falcon | 352070 | |
| Provetta per microcentrifuga da 2 mL | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantità e qualità |
| Pallone da coltura da 250 mL | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial colture |
| Provette da centrifuga da 50 mL | Falcon | 352051 | Centrifugazione per colture |
| Etanolo assoluto | VWR Sostanze chimiche | 20821.321 | Estrazione e purificazione dell'RNA |
| Centrifuga Allegra X-12R | Beckman Coulter | Pellettatura batterica | |
| Ampicilina (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Terreno di crescita |
| Resina di amilosio | Nuovo Inghilterra BioLabs | E8021S Purificazione | di affinità MS2 |
| Frammento di AF Anti-diossigenina AP Fab | Sigma Aldrich | 11093274910 | Saggi di Northern blot |
| Cassetta per autoradiografia | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Saggi di Northern blot |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Costruzione plasmidica |
| BHI (Brain Heart Infusion) Brodo | Sigma-Aldrich | 53286 | Terreno di crescita |
| Reagente bloccante | Sigma Aldrich | 11096176001 | Saggi Northern blot |
| CDP-Star Sigma | Aldrich | 11759051001 | Saggi Northern blot (substrato) |
| Centrifuga 5415 R | Eppendorf | Estrazione e purificazione dell'RNA | |
| Cloroformio | Dominique Dutscher | 508320-CER | Estrazione dell'RNA e purificazione |
| Miscela di marcatura DIG-RNA | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Saggi Northern blot |
| DNasi I | Roche | 4716728001 | DNase Trattamento con DNasi |
| Eritromicina (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Terreno di crescita |
| Dispositivo FastPrep | MP Biomedicals | 116004500 | Lisi meccanica |
| Tiocianato | di guanidioSaggi Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot |
| Ibridazione Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Saggi Northern blot |
| Provette di ibridazione | Techne | FHB16 | Saggi Northern blot |
| Alcool isoamilico | Fisher Scientific | A/6960/08 | Estrazione e purificazione dell'RNA |
| LB (brodo di lisogenia) | Sigma-Aldrich | L3022 | Terreno di coltura |
| Matrice di lisi B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Lisi meccanica |
| MicroPulser Elettroporatore | BioRad | 1652100 | Costruzione di plasmidi |
| Dispositivo per l'acqua Milli-Q | Z00QSV0WW | Acqua ultrapura | |
| Spettrofotometro NanoDrop | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantità e qualità | |
| Membrana di nitrocellulosa | Dominique Dutsher | 10600002 | Saggi Northern blot |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Pulizia e decontaminazione |
| Fenolo | Carl Roth | 38.2 | Estrazione e purificazione dell'RNA |
| Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà | New England Biolabs | M0530 | Costruzione di plasmidi |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | Produzione MS2-MBP |
| Colonna per cromatografia Poly-Prep | BioRad | 7311550 | Purificazione di affinità MS2 |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Costruzione plasmidi |
| Qubit 3 Fluorimetro | Invitrogen | 15387293 | Quantità di RNA |
| Soluzione | MP Biomedicals | 6055050 | Lisi meccanica |
| ScriptSeq Kit completo | Illumina | BB1224 | Preparazione di librerie di cDNA |
| Spettrofotometro Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Colture batteriche |
| SpeedVac Savant Dispositivo per vuoto | ThermoFisher Scientific | DNA120 | Estrazione e purificazione dell'RNA |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Saggi Northern blot |
| T4 DNA ligasi | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Costruzione del plasmide |
| TBE (Tris-Borato-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Saggi di Northern blot |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Costruzione di plasmidi |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Saggi di Northern blot |
| Processore di pellicole a raggi X | hu.q | HQ-350XT | Saggi Northern blot |
| Pellicole a raggi X Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Saggi Northern blot |
Riferimenti
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G.
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Ristampe e permessi
