Isolamento, proliferazione e differenziamento di cellule staminali derivate dall'adiposio del macaco rhesus
Summary
In questo articolo, descriviamo l’isolamento delle cellule staminali derivate dal macaco rhesus (ADSC) utilizzando un protocollo di digestione enzimatica dei tessuti. Successivamente, descriviamo la proliferazione ADSC che include il distacco cellulare, il conteggio e la placcatura. Infine, la differenziazione dell’ADSC è descritta utilizzando specifici agenti induttori adipogeni. Inoltre, descriviamo le tecniche di colorazione per confermare la differenziazione.
Abstract
Il tessuto adiposo fornisce una fonte ricca e accessibile di cellule staminali multipotenti, che sono in grado di auto-rinnovarsi. Queste cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) forniscono un sistema cellulare ex vivo coerente che è funzionalmente simile a quello degli adipociti in vivo. L’uso di ADSC nella ricerca biomedica consente l’indagine cellulare della regolazione e della funzione metabolica del tessuto adiposo. La differenziazione ADSC è necessaria per un’adeguata espansione degli adipociti e la differenziazione subottimale è un meccanismo importante della disfunzione adiposa. Comprendere i cambiamenti nella differenziazione ADSC è fondamentale per comprendere lo sviluppo della disfunzione metabolica e della malattia. I protocolli descritti in questo manoscritto, quando seguiti, produrranno adipociti maturi che possono essere utilizzati per diversi test funzionali in vitro per valutare la funzione metabolica ADSC, inclusi ma non limitati a saggi che misurano l’assorbimento del glucosio, la lipolisi, la lipogenesi e la secrezione. I macachi Rhesus (Macaca mulatta) sono fisiologicamente, anatomicamente ed evolutivamente simili agli esseri umani e come tali, i loro tessuti e cellule sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca biomedica e per lo sviluppo di trattamenti. Qui, descriviamo l’isolamento ADSC utilizzando tessuto adiposo fresco sottocutaneo e omentale ottenuto da macachi rhesus di 4-9 anni. I campioni di tessuto adiposo vengono digeriti enzimaticamente nella collagenasi seguita da filtrazione e centrifugazione per isolare le ADSC dalla frazione vascolare stromale. Le ADSC isolate sono proliferate nei mezzi stromali seguiti da circa 14-21 giorni di differenziazione utilizzando un cocktail di 0,5 μg/mL di desametasone, 0,5 mM di isobutilmetilxantina e 50 μM di indometacina nei mezzi stromali. Gli adipociti maturi sono osservati a circa 14 giorni di differenziazione. In questo manoscritto, descriviamo i protocolli per l’isolamento, la proliferazione e la differenziazione ADSC in vitro. Sebbene ci siamo concentrati sulle ADSC del tessuto adiposo del macaco rhesus, questi protocolli possono essere utilizzati per il tessuto adiposo ottenuto da altri animali con aggiustamenti minimi.
Introduction
Il tessuto adiposo è costituito da una miscela eterogenea di cellule, prevalentemente adipociti maturi e una frazione vascolare stromale comprendente fibroblasti, cellule immunitarie e cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC)1,2,3. Le ADSC primarie possono essere isolate direttamente dal tessuto adiposo bianco e stimolate a differenziarsi in adipociti, cartilagini o cellule ossee4. Le ADSC presentano caratteristiche classiche delle cellule staminali, come il mantenimento della multipotenza in vitro e l’auto-rinnovamento; e sono aderenti alla plastica in coltura 5,6. Le ADSC sono di importante interesse per l’uso nella medicina rigenerativa grazie alla loro multipotenza e alla capacità di essere facilmente raccolte in grandi quantità utilizzando tecniche non invasive7. La differenziazione adipogena delle ADSC produce cellule che imitano funzionalmente gli adipociti maturi, tra cui l’accumulo lipidico, l’assorbimento di glucosio stimolato dall’insulina, la lipolisi e la secrezione di adipochine8. La loro somiglianza con gli adipociti maturi ha portato all’uso diffuso di ADSC per lo studio fisiologico delle caratteristiche cellulari e della funzione metabolica degli adipociti. Vi è una crescente evidenza a sostegno dell’idea che lo sviluppo di disfunzioni metaboliche e disturbi abbia origine a livello cellulare o tissutale 9,10,11,12. È necessaria una differenziazione ottimale dell’ADSC per una sufficiente espansione del tessuto adiposo, una corretta funzione degli adipociti e un’efficace regolazione metabolica13.
I protocolli descritti in questo manoscritto sono tecniche semplici che utilizzano attrezzature di laboratorio standard e reagenti di base. Il manoscritto descrive innanzitutto il protocollo per l’isolamento delle ADSC primarie dal tessuto adiposo fresco mediante digestione meccanica ed enzimatica. Successivamente, viene descritto il protocollo per la proliferazione e il passaggio delle ADSC nel mezzo stromale. Infine, viene descritto il protocollo per il differenziamento adipogeno delle ADSC. Dopo la differenziazione, queste cellule possono essere utilizzate per studi per comprendere meglio il metabolismo degli adipociti e i meccanismi di disfunzione. Vengono inoltre descritti i protocolli per la conferma della differenziazione adipogenica e del rilevamento delle goccioline lipidiche mediante colorazione Oil Red O e boro-dipirrometene (BODIPY). I dettagli di questi protocolli si sono concentrati sulle ADSC primarie isolate dal tessuto adiposo omentale fresco dei macachi rhesus. Noi e altri abbiamo utilizzato questo protocollo per isolare con successo le ADSC dai depositi di tessuto adiposo sottocutaneo e omentale del macaco rhesus14,15. A parità di tessuto utilizzato, abbiamo osservato che il tessuto adiposo sottocutaneo è più denso, più duro e produce meno cellule dalla digestione rispetto al tessuto adiposo omentale. Questo protocollo è stato utilizzato anche per isolare gli ADSC da campioni adiposi umani16.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli di isolamento, proliferazione e differenziazione ADSC sono semplici e riproducibili, ma richiedono un’attenta tecnica per garantire un isolamento adeguato, un’espansione sana e una differenziazione efficiente. Un ambiente di lavoro sterile è fondamentale per tutti gli esperimenti di coltura cellulare. Batteri o funghi possono essere introdotti in colture cellulari attraverso strumenti, mezzi o ambienti di lavoro contaminati. La contaminazione fungina è indicata dalla crescita delle spore nella coltura, men…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Curtis Vande Stouwe per la sua assistenza tecnica. La ricerca alla base dello sviluppo dei protocolli è stata sostenuta da sovvenzioni del National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 e 1F31AA028459-01).
Materials
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
Riferimenti
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