Isolering, spridning och differentiering av Rhesus macaque fett-härledda stamceller

Summary

I den här artikeln beskriver vi isolering av rhesus makak härledda fett-härledda stamceller (ADSC) med hjälp av ett enzymatiskt vävnadsuppslutningsprotokoll. Därefter beskriver vi ADSC-proliferation som inkluderar cellavskiljning, räkning och plätering. Slutligen beskrivs ADSC-differentiering med användning av specifika adipogena inducerande medel. Dessutom beskriver vi färgningstekniker för att bekräfta differentiering.

Abstract

Fettvävnad ger en rik och tillgänglig källa till multipotenta stamceller, som kan förnya sig själv. Dessa fett-härledda stamceller (ADSC) ger ett konsekvent ex vivo cellulärt system som är funktionellt som det för in vivo adipocyter. Användning av ADSC i biomedicinsk forskning möjliggör cellulär undersökning av fettvävnadens metaboliska reglering och funktion. ADSC-differentiering är nödvändig för adekvat adipocytutvidgning, och suboptimal differentiering är en viktig mekanism för fettdysfunktion. Att förstå förändringar i ADSC-differentiering är avgörande för att förstå utvecklingen av metabolisk dysfunktion och sjukdom. Protokollen som beskrivs i detta manuskript, när de följs, kommer att ge mogna adipocyter som kan användas för flera in vitro-funktionella tester för att bedöma ADSC-metabolisk funktion, inklusive men inte begränsat till analyser som mäter glukosupptag, lipolys, lipogenes och utsöndring. Rhesus makaker (Macaca mulatta) är fysiologiskt, anatomiskt och evolutionärt lika människor och som sådana har deras vävnader och celler använts i stor utsträckning i biomedicinsk forskning och för utveckling av behandlingar. Här beskriver vi ADSC-isolering med färsk subkutan och omental fettvävnad erhållen från 4-9-åriga rhesusmakaker. Fettvävnadsprover smälts enzymatiskt i kollagenas följt av filtrering och centrifugering för att isolera ADSC från den stromala vaskulära fraktionen. Isolerade ADSC prolifereras i stromala medier följt av cirka 14–21 dagars differentiering med användning av en cocktail av 0,5 μg / ml dexametason, 0,5 mM isobutylmetylxantin och 50 μM indometacin i stromala medier. Mogna adipocyter observeras vid ungefär 14 dagars differentiering. I detta manuskript beskriver vi protokoll för ADSC-isolering, spridning och differentiering in vitro. Även om vi har fokuserat på ADSC från rhesus makak fettvävnad, kan dessa protokoll användas för fettvävnad erhållen från andra djur med minimala justeringar.

Introduction

Fettvävnad består av en heterogen blandning av celler, övervägande mogna adipocyter och en stromal vaskulär fraktion inklusive fibroblaster, immunceller och fett-härledda stamceller (ADSC)^1,2,3. Primära ADSC kan isoleras direkt från vit fettvävnad och stimuleras att differentieras till adipocyter, brosk eller benceller⁴. ADSC uppvisar klassiska stamcellsegenskaper såsom upprätthållande av multipotens in vitro och självförnyelse; och är vidhäftande till plast i kultur ^5,6. ADSC är av viktigt intresse för användning inom regenerativ medicin på grund av deras multipotens och förmåga att enkelt skördas i stora mängder med hjälp av icke-invasiva tekniker⁷. Adipogen differentiering av ADSC producerar celler som funktionellt efterliknar mogna adipocyter inklusive lipidackumulering, insulinstimulerat glukosupptag, lipolys och adipokinsekretion⁸. Deras likhet med mogna adipocyter har lett till utbredd användning av ADSC för fysiologisk undersökning av cellulära egenskaper och metabolisk funktion av adipocyter. Det finns ökande bevis som stöder tanken att utvecklingen av metabolisk dysfunktion och störningar har sitt ursprung på cell- eller vävnadsnivå 9,10,11,12. Optimal ADSC-differentiering krävs för tillräcklig fettvävnadsutvidgning, korrekt adipocytfunktion och effektiv metabolisk reglering¹³.

Protokoll som beskrivs i detta manuskript är enkla tekniker som använder standard laboratorieutrustning och grundläggande reagenser. Manuskriptet beskriver först protokollet för isolering av primära ADSC från färsk fettvävnad med hjälp av mekanisk och enzymatisk matsmältning. Därefter beskrivs protokollet för spridning och passering av ADSC i stromalt medium. Slutligen beskrivs protokollet för adipogen differentiering av ADSC. Efter differentiering kan dessa celler användas för studier för att bättre förstå adipocytmetabolism och mekanismer för dysfunktion. Protokollen för bekräftelse av adipogen differentiering och lipiddroppdetektering med användning av Oil Red O och bor-dipyrromethene (BODIPY) färgning beskrivs också. Detaljerna i dessa protokoll fokuserade på primära ADSC isolerade från färsk omental fettvävnad av rhesus makaker. Vi och andra har använt detta protokoll för att framgångsrikt isolera ADSC från rhesus macaque subkutan och omental fettvävnad depåer^14,15. För samma mängd vävnad som används har vi observerat att subkutan fettvävnad är tätare, hårdare och ger mindre celler från matsmältningen jämfört med omental fettvävnad. Detta protokoll har också använts för att isolera ADSC från humana fettprover¹⁶.

Protocol

Alla erhållna vävnader och procedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Louisiana State University Health Sciences Center och utfördes i enlighet med riktlinjerna från National Institute of Health (NIH-publikation nr 85-12, reviderad 1996). 1. Beredning av buffertar och lösningar Förbered steril 5-fosfatbuffrad saltlösningsbuffert (5-PBS) genom att tillsätta 5% penicillin / streptomycin (penna / strep) och 0,25 μg / ml svamphämmare till 1x PBS. F…

Representative Results

ADSC: erna isolerade från rhesus makak fettvävnadsprover såddes på odlingsplattor och visas i figur 1. På pläteringsdagen är cellerna icke-vidhäftande och flyter i odlingsskålen som visas i figur 1A. Inom 72 timmar blir ADSC 80% sammanflytande och är redo för adipocytdifferentiering (figur 1B). ADSC uppvisar starka adipogena egenskaper efter kemisk induktion. Efter 14 dagars differentiering kan mogna adipocyter observeras…

Discussion

ADSC-isolerings-, spridnings- och differentieringsprotokoll är enkla och reproducerbara, men de kräver noggrann teknik för att säkerställa adekvat isolering, hälsosam expansion och effektiv differentiering. En steril arbetsmiljö är avgörande för alla cellodlingsexperiment. Bakterier eller svampar kan föras in i cellkulturer genom förorenade verktyg, medier eller arbetsmiljö. Svampförorening indikeras av sportillväxt i kulturen, medan bakteriell förorening indikeras av närvaron av grumlighet hos mediet. V…

Materials

0.4 % trypan blue	Thermo-Fisher	15250061
1.5-ml microcentrifuge tube	Dot Scientific	707-FTG
100 % isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1838-P
100-mm cell culture dish	Corning	430167
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018
50-mL plastic conical tube	Fisher Scientific	50-465-232
70-µm cell strainer	Corning	CLS431751
a-MEM	Thermo-Fisher	12561056
Aluminum foil	Reynolds Wrap
BODIPY	Thermo-Fisher	D3922
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	05470
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Collagenase, Type I	Thermo-Fisher	17100017
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma-Aldrich	D2915
Dimethyl sulfoxide, DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Distilled water	Thermo-Fisher	15230162
Fetal Bovine Serum, USDA-approved	Sigma-Aldrich	F0926
Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL)	Thermo-Fisher	15290018
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14175095
Hemacytometer with cover slip	Sigma-Aldrich	Z359629
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Inverted light microscope	Nikon	DIAPHOT-TMD
L-glutamine (200 mM)	Thermo-Fisher	25030081
Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz	Reliable Scientific	Model 55 Rocking
Neutral buffered formalin (10 %)	Pharmco	8BUFF-FORM
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
Paraformeldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo-Fisher	15140122
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo-Fisher	10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer	Qiagen	158904
Serological pipettes, 2 to 25 mL	Costar Stripettes
Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2	Sanyo	MCO-17AIC
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo-Fisher	25200056