Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda och montera Caenorhabditis elegans-embryon , registrera utveckling under ett 4D-mikroskop och spåra celllinje.
4D-mikroskopi är ett ovärderligt verktyg för att reda ut den embryonala utvecklingsprocessen hos olika djur. Under de senaste decennierna har Caenorhabditis elegans framstått som en av de bästa modellerna för att studera utveckling. Ur optisk synvinkel gör dess storlek och transparenta kropp denna nematod till ett idealiskt prov för DIC-mikroskopi (Differential Interference Contrast eller Nomarski). Denna artikel illustrerar ett protokoll för odling av C. elegans nematoder, förberedelse och montering av deras embryon, utförande av 4D-mikroskopi och spårning av celllinjer. Metoden bygger på multifokala time-lapse-poster av Nomarski-bilder och analys med specifik programvara. Denna teknik avslöjar embryonal utvecklingsdynamik på cellulär nivå. Varje embryonal defekt hos mutanter, såsom problem i spindelorientering, cellmigration, apoptos eller cellödespecifikation, kan effektivt detekteras och poängsättas. Praktiskt taget varje enskild cell i embryot kan följas upp till det ögonblick som embryot börjar röra sig. Att spåra hela cellinjen hos ett C. elegans-embryo med 4D DIC-mikroskopi är mödosamt, men användningen av specifik programvara underlättar denna uppgift avsevärt. Dessutom är denna teknik lätt att implementera i labbet. 4D-mikroskopi är ett mångsidigt verktyg och öppnar möjligheten att utföra en oöverträffad analys av embryonal utveckling.
4D-mikroskopi är ett multifokalt time-lapse-inspelningssystem som gör det möjligt för forskare att registrera och kvantifiera celldynamiken i ett biologiskt prov både rumsligt och över tid. Cellkulturer, jäst eller levande vävnader kan utsättas för 4D-analys men denna teknik är särskilt lämpad för att analysera utvecklingen av levande embryon. Upplösningen av denna analys når nivån på varje enskild cell i embryot. Varje celldelning kan detekteras och cellrörelser kan spåras över tiden. Cellöden bedöms enligt den position och form som cellerna förvärvar. Användningen av Nomarski-optik förbättrar kontrasten hos ofärgade transparenta prover med hjälp av ortogonalt polariserade ljusstrålar som stör vid fokalplanet. De resulterande bilderna verkar tredimensionella, upplysta på ena sidan.
Andra metoder baserade på användning av konfokalmikroskopi och GFP-transgena djur för automatisk detektion av kärnor och generering av cellinjer har utvecklats 1,2. Fördelen med dessa system är uppenbar: programvaran åsidosätter i hög grad behovet av att manuellt markera varje kärna under en tidsperiod (även om viss manuell övervakning krävs under de sena stadierna). Cellulära processer som involverar förändringar i cellform eller membrandynamik, såsom de som uppstår under celldifferentiering, migration, apoptos eller likuppslukning, förblir emellertid dolda som en svart bakgrund i de fluorescerande märkta kärnbilderna.
Däremot visar 4D Nomarski-mikroskopi (även kallad DIC-mikroskopi, differentialinterferenskontrastmikroskopi) både kärnor och cellformförändringar som uppstår under utvecklingen av vilda eller mutanta djur. Detta möjliggör spårning av celllinjer med hjälp av standardmikroskop, som endast använder överfört ljus. Det finns inget allmänt behov av att använda transgena djur förutom att visa specifika uttrycksmönster, i vilket fall fluorescerande skanningar kan interkaleras. Därför kan detta vara det optimala tillvägagångssättet för många laboratorier som arbetar med dynamiska cellprocesser som embryogenes eller apoptos som kan belysas under DIC-mikroskopi 3,4,5,6,7.
Flera flexibla och användarvänliga program finns tillgängliga för att fånga mikroskopiska bilder och rekonstruera cellinjer, 3D-modeller, cellmigrationsvägar etc. i det inspelade provet. I ett standardexperiment förvärvas bilder i en serie fokalplan, på ett konstant avstånd, vars antal beror på provtjockleken. Analysens tidsmässiga upplösning kan optimeras genom att öka skanningsfrekvensen. Det finns praktiskt taget ingen annan gräns för inspelningens varaktighet än datorns lagringskapacitet. Till exempel, för en C. elegans embryoutvecklingsanalys, förvärvar vi rutinmässigt bilder på 30 fokala plan (1 mikronsteg vardera), var 30: e sekund i 12 timmar.
Dessa system har tillämpats på analys av flera djurembryon såsom Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, andra nematodembryon12,13, tardigrades14,15 och till och med tidiga musembryon16. Det enda kravet är att ha ett transparent embryo som kan utvecklas på glidberedningen under mikroskopet.
Sammanfattningsvis är DIC-baserad 4D-mikroskopi särskilt användbar för 1) analys av embryonal utveckling av små, transparenta djur: spårning av celllinje, cellmigrationsvägar, generering av 3D-modeller etc; 2) definiera genuttrycksmönster; 3) studera cellodlingsdynamik, från jäst till mänskliga celler; 4) analysera vävnadsdynamik eller embryofragment; 5) kvantifiering av celldödskinetik och likinflätning; och 6) utföra jämförande fylogenianalys baserad på embryonala utvecklingsegenskaper. Om det finns intresse för något av dessa ämnen (eller liknande) kan 4D-mikroskopi användas.
En av de stora utmaningarna i modern biologi är att förstå utvecklingen av flercelliga organismer. C. elegans har framstått som en av de bäst lämpade modellerna för att studera den fina samordningen mellan cellproliferation och celldifferentiering i det utvecklande embryot. Ur optisk synvinkel gör dess transparenta kropp och dess lilla storlek denna nematod till ett idealiskt prov för DIC-mikroskopi. Andra organismer med liknande egenskaper har också utsatts för 4D-mikroskopianalys 11,12,13,14,15,16.
För dessa utvecklingsstudier ger geninaktivering av antingen framåt eller omvänd genetik en ledtråd till dess engagemang i embryogenes. När en gen har visat sig spela en roll i utvecklingen är nästa steg att definiera dess exakta roll i upprättandet av rätt kroppsplan. Immunfärgning är det valda tillvägagångssättet för de flesta modeller. Denna teknik belyser problem i celldifferentiering eller uttryck av specifika markörer. En stor begränsning med detta tillvägagångssätt är dock att det bara ger en statisk bild av uttrycket av en enda eller flera markörer vid en fast punkt i utvecklingen. En dynamisk bild av dessa markörer under hela utvecklingen kan endast erhållas genom färgning av olika embryon vid olika tidpunkter. Dessutom är rekonstruktion av celllinje inte möjlig i sådana fasta prover.
4D-mikroskopi är ett kompletterande tillvägagångssätt för att studera embryonal utveckling. Denna teknik avslöjar utvecklingsdynamik vid en upplösning på cellnivå. Eventuella defekter i embryot som problem i spindelorientering, cellmigration, apoptos, cellödesspecifikation etc. kommer att dyka upp i en 4D-film som kan visualiseras framåt och bakåt, kvantifieras och poängsättas av forskaren. Med hjälp av denna teknik kan praktiskt taget varje cell i embryot följas upp till det ögonblick som embryot börjar röra sig. Embryon som utsätts för 4D-mikroskopi med endast synligt ljus och Nomarski-optik drabbas inte av fotoskador. Fluorescerande skanningar kan också interkaleras inom inspelningen för att detektera när och var en gen uttrycks. Embryon som drabbas av betydande fotoskador identifieras av cellcykelförlängningen som orsakar stark UV-bestrålning jämfört med ett vanligt WT-härstamningsembryo. I så fall kan fotoskador minskas genom att sänka UV-lampans intensitet och öka kamerans känslighet eller exponeringstid. Morfologiska egenskaper och molekylära markörer kan hjälpa till att klargöra den embryonala utvecklingen av någon mutant.
Att inrätta ett 4D-mikroskopisystem är lätt att implementera i laboratoriet och möjliggör efter viss övning en oöverträffad analys av celldynamik och härstamningsspårning av cellkulturer och levande transparenta prover på en upplösningsnivå för varje cell i mikroskopfältet. Spårning av cellinjer på DIC-bilder bearbetas fortfarande för hand. Det är tidskrävande och även om programvaran upptäcker härstamningsfel som olika härstamningsgrenar som markerar samma cell, är misstag möjliga. Medan automatisk detektion av GFP-märkta celler är välutvecklad2, är kompletterande härstamningsspårningsprogramvara baserad på omärkta celler och bilder av synligt ljus fortfarande i ett tidigt skede och inte riktigt användbart för en fullständig embryoanalys. Utan tvekan kommer tillämpningen av bildigenkänningssystem på området synlig ljusmikroskopi att medföra ett stort framsteg inom detta område.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna stöd från Rioja Salud Foundation (Fondos FEDER) och spanska Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda finansieras av ett stipendium från AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).
Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
Cell Lineage Tracing software | SIMI | Simi BioCell | This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
Microscope camera | Hamamatsu | Orca-R2 | Miscroscope camera for both transmitted and UV light |
Microscope control software | Caenotec | Time to Live | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
Microscope control software | Micro-manager | Micro-manager | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/ |
Motorized microscope | Leica | Leica DM6000 | Motorized upright microscope to perform 4D microscopy |
Standard equipment in a Molecular Biology lab. | |||
Stereomicroscope | Leica | MZ16FA | Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos. |