Обогащенная фибрином и чувствительная к tPA модель фототромботического инсульта
Summary
Традиционные модели фототромботического инсульта (ПТС) в основном индуцируют плотные агрегаты тромбоцитов с высокой резистентностью к тканевой терапии активатором плазминогена (tPA)-литическим лечением. Здесь модифицированная мышиная модель ПТС вводится путем совместного введения тромбина и фоточувствительного красителя для фотоактивации. Модель ПТС, усиленная тромбином, производит смешанные тромбоцитарно-фибриновые сгустки и обладает высокой чувствительностью к tPA-тромболизису.
Abstract
Идеальная модель тромбоэмболического инсульта требует определенных свойств, в том числе относительно простых хирургических процедур с низкой смертностью, постоянного размера и локализации инфаркта, осаждения тромбоцитов и сгустков крови с примесью тромбоцитов и фибрина, аналогичных таковым у пациентов, и адекватной чувствительности к фибринолитическому лечению. Модель фототромботического инсульта на основе красителя бенгальской розы (RB) отвечает первым двум требованиям, но обладает высокой рефрактерностью к tPA-опосредованному литической терапии, предположительно из-за богатого тромбоцитами, но бедного фибрином состава сгустков. Мы полагаем, что комбинация RB-красителя (50 мг/кг) и субтромботической дозы тромбина (80 ЕД/кг) для фотоактивации, направленной на проксимальную ветвь средней мозговой артерии (МЦА), может приводить к образованию обогащенных фибрином и tPA-чувствительных тромбов. Действительно, модель комбинированного фототромбоза с тромбином и RB (T+RB) вызывала смешанные тромбоцитарно-фибриновые тромбы, как показали иммуноокрашивание и иммуноблоты, и поддерживала постоянные размеры и локализацию инфаркта плюс низкую смертность. Кроме того, внутривенное введение tPA (Alteplase, 10 мг/кг) в течение 2 ч после фотоактивации значительно уменьшало размер инфаркта при фототромбозе T+RB. Таким образом, модель фототромботического инсульта, усиленная тромбином, может быть полезной экспериментальной моделью для тестирования новых методов тромболитической терапии.
Introduction
Эндоваскулярная тромбэктомия и tPA-опосредованный тромболизис являются единственными двумя одобренными Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) методами лечения острого ишемического инсульта, которым ежегоднов Соединенных Штатах страдают ~700 000 пациентов. Поскольку применение тромбэктомии ограничено окклюзией крупных сосудов (LVO), в то время как tPA-тромболизис может облегчить окклюзию мелких сосудов, оба метода лечения острого ишемического инсульта2 являются ценными. Кроме того, комбинация обоих методов лечения (например, начало tPA-тромболизиса в течение 4,5 часов после начала инсульта с последующей тромбэктомией) улучшает реперфузию и функциональные исходы3. Таким образом, оптимизация тромболизиса остается важной целью для исследований инсульта, даже в эпоху тромбэктомии.
Тромбоэмболические модели являются важным инструментом для доклинических исследований инсульта, направленных на улучшение тромболитической терапии. Это связано с тем, что модели механической окклюзии сосудов (например, внутрипросветная окклюзия MCA) не приводят к образованию тромбов, а быстрое восстановление мозгового кровотока после удаления механической окклюзии чрезмерно идеализировано 4,5. На сегодняшний день основные модели тромбоэмболии включают фототромбоз 6,7,8, местное применение хлорида железа (FeCl3)9, микроинъекцию тромбина в ветвь MCA 10,11, инъекцию ex vivo (микро)эмболии в MCA или общую сонную артерию (CCA)12,13,14 и транзиторную гипоксию-ишемию (tHI)15,16, 17,18. Эти модели инсульта различаются по гистологическому составу последующих тромбов и чувствительности к tPA-опосредованной литической терапии (табл. 1). Они также различаются по хирургическому требованию трепанации черепа (необходимой для инъекции тромбина in situ и местного применения FeCl3), постоянству размера и расположения инфаркта (например, CCA-инфузия микроэмболов дает очень разные результаты) и глобальному воздействию на сердечно-сосудистую систему (например, tHI увеличивает частоту сердечных сокращений и сердечный выброс, чтобы компенсировать вызванную гипоксией периферическую вазодилатацию).
Модель фототромботического инсульта (ПТС) на основе красителя RB имеет много привлекательных особенностей, включая простые хирургические процедуры без трепанации черепа, низкую смертность (обычно < 5%) и предсказуемый размер и расположение инфаркта (на территории, поставляющей MCA), но у нее есть два основных ограничения. 8 Первое предостережение – слабый или нулевой ответ на tPA-опосредованную тромболитическую терапию, что также является недостатком модели FeCl3 7,19,20. Второе предостережение моделей инсульта PTS и FeCl3 заключается в том, что последующие тромбы состоят из плотно упакованных агрегатов тромбоцитов с небольшим количеством фибрина, что не только приводит к их устойчивости к tPA-литической терапии, но и отклоняется от картины смешанных тромбоцитов:фибриновых тромбов у пациентов с острым ишемическим инсультом21,22. В отличие от этого, модель микроинъекций тромбина in situ в основном включает полимеризованный фибрин и неопределенное содержание тромбоцитов10.
Учитывая вышеизложенное, мы предположили, что примесь RB и субтромботической дозы тромбина для MCA-направленной фотоактивации через истонченный череп может увеличить фибриновый компонент в образующихся тромбах и повысить чувствительность к tPA-опосредованному литическому лечению. Мы подтвердили эту гипотезу,23 и в данной статье подробно описываем процедуры модифицированной (Т+РБ) модели фототромботического инсульта.
Protocol
Representative Results
Discussion
Традиционный RB-фототромботический инсульт, представленный в 1985 году, является привлекательной моделью фокальной ишемии головного мозга для простых хирургических процедур, низкой смертности и высокой воспроизводимости инфаркта головного мозга. 5 В этой модели фотодинами…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH (NS108763, NS100419, NS095064 и HD080429 для C.Y.K.; и NS106592 для Y.Y.S.).
Materials
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Meloxicam SR | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
Riferimenti
- Lyden, P. D. . Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
