En fibrinberiget og tPA-følsom fototrombotisk slagtilfældemodel
Summary
Traditionelle fototrombotiske slagtilfælde (PTS) modeller inducerer hovedsageligt tætte blodpladeaggregater med en høj modstandsdygtighed over for vævsplasminogenaktivator (tPA)-lytisk behandling. Her introduceres en modificeret murin PTS-model ved samtidig injektion af thrombin og lysfølsomt farvestof til fotoaktivering. Den trombinforstærkede PTS-model producerer blandede blodplader: fibrinpropper og er meget følsom over for tPA-trombolyse.
Abstract
En ideel tromboembolisk slagtilfældemodel kræver visse egenskaber, herunder relativt enkle kirurgiske procedurer med lav dødelighed, en konsekvent infarktstørrelse og placering, udfældning af blodplader:fibrin blandede blodpropper svarende til dem hos patienter og en tilstrækkelig følsomhed over for fibrinolytisk behandling. Den rosenbengalske (RB) farvestofbaserede fototrombotiske slagtilfældemodel opfylder de to første krav, men er meget ildfast over for tPA-medieret lytisk behandling, formodentlig på grund af dens blodpladerige, men fibrinfattige koagulationssammensætning. Vi ræsonnerer, at kombinationen af RB-farvestof (50 mg / kg) og en subtrombotisk dosis thrombin (80 E / kg) til fotoaktivering rettet mod den proksimale gren af den midterste cerebrale arterie (MCA) kan producere fibrinberigede og tPA-følsomme blodpropper. Faktisk udløste trombin- og RB (T + RB) -kombineret fototrombosemodel blandet blodplade: fibrinblodpropper, som vist ved immunfarvning og immunoblots, og opretholdt konsistente infarktstørrelser og placeringer plus lav dødelighed. Desuden reducerede intravenøs injektion af tPA (Alteplase, 10 mg/kg) inden for 2 timer efter fotoaktivering signifikant infarktstørrelsen ved T+RB-fototrombose. Således kan den trombinforstærkede fototrombotiske slagtilfældemodel være en nyttig eksperimentel model til test af nye trombolytiske terapier.
Introduction
Endovaskulær trombektomi og tPA-medieret trombolyse er de eneste to amerikanske Food and Drug Administration (FDA) -godkendte terapier af akut iskæmisk slagtilfælde, der rammer ~ 700.000 patienter årligt i USA1. Fordi anvendelsen af trombektomi er begrænset til stor karokklusion (LVO), mens tPA-trombolyse kan lindre små karokklusioner, er begge værdifulde terapier af akut iskæmisk slagtilfælde2. Desuden forbedrer kombinationen af begge terapier (f.eks. initiering af tPA-trombolyse inden for 4,5 timer efter slagtilfælde efterfulgt af trombektomi) reperfusion og de funktionelle resultater3. Således forbliver optimering af trombolyse et vigtigt mål for slagtilfældeforskning, selv i trombektomiens æra.
Tromboemboliske modeller er et vigtigt redskab til præklinisk slagtilfældeforskning, der sigter mod at forbedre trombolytiske terapier. Dette skyldes, at mekaniske vaskulære okklusionsmodeller (f.eks. intraluminal sutur MCA-okklusion) ikke producerer blodpropper, og dens hurtige genopretning af cerebral blodgennemstrømning efter fjernelse af mekanisk okklusion er alt for idealiseret 4,5. Til dato omfatter større tromboemboliske modeller fototrombose 6,7,8, topisk jernchlorid (FeCl3) applikation9, mikroinjektion af thrombin i MCA-grenen 10,11, injektion af ex vivo (mikro)emboli i MCA eller almindelig carotisarterie (CCA)12,13,14 og forbigående hypoxi-iskæmi (tHI)15,16, 17,18. Disse slagtilfældemodeller adskiller sig i den histologiske sammensætning af efterfølgende blodpropper og følsomheden over for tPA-medierede lytiske terapier (tabel 1). De varierer også i det kirurgiske krav til kraniotomi (nødvendigt for in situ trombininjektion og topisk anvendelse afFeCl3), konsistensen af infarkts størrelse og placering (f.eks. CCA-infusion af mikroemboli giver meget variable resultater) og globale virkninger på det kardiovaskulære system (f.eks. øger tHI hjertefrekvensen og hjerteudgangen for at kompensere for hypoxi-induceret perifer vasodilatation).
RB-farvestofbaseret fototrombotisk slagtilfælde (PTS) -modellen har mange attraktive funktioner, herunder enkle kraniotomifrie kirurgiske procedurer, lav dødelighed (typisk < 5%) og en forudsigelig størrelse og placering af infarkt (i MCA-forsyningsområdet), men den har to store begrænsninger. 8 Den første advarsel er svag til nul respons på tPA-medieret trombolytisk behandling, hvilket også er en ulempe ved FeCl3-model 7,19,20. Den anden advarsel ved PTS- og FeCl 3-taktsmodeller er, at den efterfølgende trombi består af tætpakkede blodpladeaggregater med en lille mængde fibrin, hvilket ikke kun fører til dets modstandsdygtighed over for tPA-lytisk terapi, men også afviger fra mønsteret af blandet blodplade: fibrintrombi hos patienter med akut iskæmisk slagtilfælde 21,22. I modsætning hertil omfatter in situ thrombin-mikroinjektionsmodellen hovedsageligt polymeriseret fibrin og et usikkert indhold af blodplader10.
På baggrund af ovenstående ræsonnement antog vi, at blanding af RB og en subtrombotisk dosis thrombin til MCA-målrettet fotoaktivering gennem fortyndet kranium kan øge fibrinkomponenten i den resulterende trombi og øge følsomheden over for tPA-medieret lytisk behandling. Vi har bekræftet denne hypotese,23 og heri beskriver vi detaljerede procedurer for den modificerede (T+RB) fototrombotiske slagtilfældemodel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det traditionelle RB fototrombotiske slagtilfælde, der blev introduceret i 1985, er en attraktiv model for fokal cerebral iskæmi til enkle kirurgiske procedurer, lav dødelighed og høj reproducerbarhed af hjerneinfarkt. 5 I denne model aktiverer det fotodynamiske farvestof RB hurtigt blodplader ved lysexcitation, hvilket fører til tætte aggregater, der okkluderer blodkarret 5,8,23. Den lille mængde …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud (NS108763, NS100419, NS095064 og HD080429 til C.Y. K. og NS106592 til YS).
Materials
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Meloxicam SR | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
Riferimenti
- Lyden, P. D. . Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
