Un modello di ictus fototrombotico arricchito di fibrina e sensibile al tPA

Summary

I modelli tradizionali di ictus fototrombotico (PTS) inducono principalmente aggregati piastrinici densi con un’elevata resistenza al trattamento litico con attivatore tissutale del plasminogeno (tPA). Qui viene introdotto un modello PTS murino modificato co-iniettando trombina e colorante fotosensibile per la fotoattivazione. Il modello PTS potenziato con trombina produce coaguli misti piastrina:fibrina ed è altamente sensibile alla trombolisi tPA.

Abstract

Un modello ideale di ictus tromboembolico richiede determinate proprietà, tra cui procedure chirurgiche relativamente semplici con bassa mortalità, dimensioni e posizione dell’infarto coerenti, precipitazione di coaguli di sangue misto piastrino-fibrina simili a quelli dei pazienti e un’adeguata sensibilità al trattamento fibrinolitico. Il modello di ictus fototrombotico a base di colorante rosa bengala (RB) soddisfa i primi due requisiti, ma è altamente refrattario al trattamento litico mediato da tPA, presumibilmente a causa della sua composizione del coagulo ricca di piastrine, ma povera di fibrina. Ragioniamo che la combinazione di colorante RB (50 mg/kg) e una dose sub-trombotica di trombina (80 U/kg) per la fotoattivazione mirata al ramo prossimale dell’arteria cerebrale media (MCA) può produrre coaguli arricchiti di fibrina e sensibili al tPA. Infatti, il modello di fototrombosi combinato con trombina e RB (T+RB) ha innescato coaguli di sangue misti piastrina:fibrina, come dimostrato dall’immunocolorazione e dagli immunoblots, e ha mantenuto dimensioni e posizioni dell’infarto coerenti, oltre a una bassa mortalità. Inoltre, l’iniezione endovenosa di tPA (Alteplase, 10 mg/kg) entro 2 ore dalla fotoattivazione ha ridotto significativamente le dimensioni dell’infarto nella fototrombosi T+RB. Pertanto, il modello di ictus fototrombotico potenziato dalla trombina può essere un utile modello sperimentale per testare nuove terapie trombolitiche.

Introduction

La trombectomia endovascolare e la trombolisi mediata da tPA sono le uniche due terapie approvate dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti per l’ictus ischemico acuto, che affligge ~700.000 pazienti all’anno^{negli Stati Uniti}. Poiché l’applicazione della trombectomia è limitata all’occlusione dei grandi vasi (LVO), mentre la trombolisi tPA può alleviare le occlusioni dei piccoli vasi, entrambe sono terapie preziose per l’ictus ischemico acuto². Inoltre, la combinazione di entrambe le terapie (ad esempio, l’inizio della trombolisi tPA entro 4,5 ore dall’insorgenza dell’ictus, seguita da trombectomia) migliora la riperfusione e gli esiti funzionali³. Pertanto, l’ottimizzazione della trombolisi rimane un obiettivo importante per la ricerca sull’ictus, anche nell’era della trombectomia.

I modelli tromboembolici sono uno strumento essenziale per la ricerca preclinica sull’ictus che mira a migliorare le terapie trombolitiche. Ciò è dovuto al fatto che i modelli di occlusione vascolare meccanica (ad esempio, l’occlusione MCA della sutura intraluminale) non producono coaguli di sangue e il suo rapido recupero del flusso sanguigno cerebrale dopo la rimozione dell’occlusione meccanica è eccessivamente idealizzato ^4,5. Ad oggi, i principali modelli tromboembolici includono la fototrombosi ^6,7,8, l’applicazione topica di cloruro ferrico (FeCl₃)⁹, la microiniezione di trombina nel ramo MCA 10,11, l’iniezione di (micro)emboli ex vivo nell’MCA o nell’arteria carotide comune (CCA)12,13,14 e l’ipossia-ischemia transitoria (tHI)^{15,16, 17,18}. Questi modelli di ictus differiscono nella composizione istologica dei coaguli che ne derivano e nella sensibilità alle terapie litiche mediate da tPA (Tabella 1). Variano anche nella necessità chirurgica di craniotomia (necessaria per l’iniezione di trombina in situ e l’applicazione topica di FeCl₃), nella consistenza delle dimensioni e della posizione dell’infarto (ad esempio, l’infusione di microemboli da parte di CCA produce risultati molto variabili) e negli effetti globali sul sistema cardiovascolare (ad esempio, il tHI aumenta la frequenza cardiaca e la gittata cardiaca per compensare la vasodilatazione periferica indotta dall’ipossia).

Il modello di ictus fototrombotico (PTS) basato su coloranti RB ha molte caratteristiche interessanti, tra cui semplici procedure chirurgiche senza craniotomia, bassa mortalità (in genere < 5%) e dimensioni e posizione prevedibili dell'infarto (nel territorio di fornitura di MCA), ma presenta due principali limitazioni. ⁸ Il primo avvertimento è la risposta debole a nulla al trattamento trombolitico mediato da tPA, che è anche uno svantaggio del modello^FeCl ₃ ^7,19,20. Il secondo avvertimento dei modelli di ictus PTS e FeCl₃ è che i trombi che ne derivano sono costituiti da aggregati piastrinici densamente impacchettati con una piccola quantità di fibrina, che non solo portano alla sua resilienza alla terapia tPA-litica, ma si discostano anche dal modello di trombi piastrinici:fibrina misti nei pazienti con ictus ischemico acuto^21,22. Al contrario, il modello di microiniezione di trombina in situ comprende principalmente fibrina polimerizzata e un contenuto incerto di piastrine¹⁰.

Dato il ragionamento di cui sopra, abbiamo ipotizzato che la miscela di RB e una dose sub-trombotica di trombina per la fotoattivazione mirata a MCA attraverso il cranio assottigliato possa aumentare la componente di fibrina nei trombi risultanti e aumentare la sensibilità al trattamento litico mediato da tPA. Abbiamo confermato questa ^ipotesi,23 e qui descriviamo in dettaglio le procedure del modello di ictus fototrombotico modificato (T+RB).

Protocol

Questo protocollo è approvato dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università della Virginia e segue le linee guida del National Institutes of Health per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. La Figura 1A delinea la sequenza delle procedure chirurgiche di questo protocollo. 1. Impostazione dell’intervento chirurgico Posizionare un tappetino riscaldante con temperatura impostata a 37 °C sull’adattatore per animali di pi…

Representative Results

In primo luogo, abbiamo confrontato il contenuto di fibrina in RB rispetto ai coaguli di sangue indotti dalla fototrombosi T+RB. I topi sono stati sacrificati mediante perfusione transcardica di fissativi a 2 ore dopo la fotoattivazione e i cervelli sono stati rimossi per la colorazione a immunofluorescenza del ramo MCA nei piani longitudinali e trasversali. Nella fototrombosi RB, il ramo MCA era densamente impacchettato con piastrine CD41+ e poca fibrina (Figura 2A,C</str…

Discussion

L’ictus fototrombotico RB tradizionale, introdotto nel 1985, è un modello interessante di ischemia cerebrale focale per semplici procedure chirurgiche, bassa mortalità e alta riproducibilità dell’infarto cerebrale. ⁵ In questo modello, il colorante fotodinamico RB attiva rapidamente le piastrine all’eccitazione della luce, portando a densi aggregati che occludono il vaso sanguigno ^5,8,23. Tuttavia, la …

Materials

2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877	infarct
4-0 Nylon monofilament suture	LOOK	766B	surgical supplies
5-0 silk suture	Harvard Apparatus	624143	surgical supplies
543nm laser beam	Melles Griot	25-LGP-193-249	photothrombosis
adult male mice	Charles River	C57BL/6	10~14 weeks old (22~30 g)
Anesthesia bar for mouse adaptor	machine shop, UVA		surgical setup
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	euthanasia
Dental drill	Dentamerica	Rotex 782	surgical setup
Digital microscope	Dino-Lite	AM2111	brain imaging
Dissecting microscope	Olympus	SZ40	surgical setup
Fine curved forceps (serrated)	FST	11370-31	surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)	FST	11373-12	surgical instrument
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Immunohistochemistry
Halsted-Mosquito hemostats	FST	13008-12	surgical instrument
Heat pump with warming pad	Gaymar	TP700	surgical setup
infusion pump	KD Scientific	200	thrombolytic treatment
Insulin syringe with 31G needle	BD	328291	photothrombosis
Ketamine	CCM, UVA		anesthesia
Laser protective google 532nm	Thorlabs	LG3	photothrombosis
Meloxicam SR	CCM, UVA		NSAID analgesia
micro needle holders	FST	12060-01	surgical instrument
micro scissors	FST	15000-03	surgical instrument
MoorFLPI-2 blood flow imager	Moor	780-nm laser source	Laser Speckle Contrast Imaging
Mouse adaptor	RWD	68014	surgical setup
Puralube Vet ointment	Fisher	NC0138063	eye dryness prevention
Retractor tips	Kent Scientific	Surgi-5014-2	surgical setup
Rose Bengal	Sigma	198250	photothrombosis
Thrombin	Sigma	T7513	photothrombosis
Tissue glue	Abbott Laboratories	NC9855218	surgical supplies
tPA	Genetech	Cathflo activase 2mg	thrombolytic treatment
Vibratome	Stoelting	51425	TTC infacrt
Xylazine	CCM, UVA		anesthesia