बैक्टीरियल एंडोफ्थैल्माइटिस के माउस मॉडल में संक्रमण मापदंडों का इंट्राविट्रियल इंजेक्शन और क्वांटिटेशन
Summary
हम यहां बैक्टीरियल एंडोफ्थैल्माइटिस के माउस मॉडल में इंट्राविट्रियल इंजेक्शन और बाद में बैक्टीरियल क्वांटिटेशन की एक विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और जीवाणु और मेजबान जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
Abstract
इंट्राओकुलर बैक्टीरियल संक्रमण दृष्टि के लिए खतरा हैं। शोधकर्ताओं ने पशु मॉडल का उपयोग मेजबान और जीवाणु कारकों और संक्रमण से जुड़े प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रास्तों की जांच करने के लिए व्यवहार्य चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने और अंधापन को रोकने के लिए दवाओं का परीक्षण करने के लिए । इंट्राविट्रियल इंजेक्शन तकनीक का उपयोग आंखों के पीछे के खंड में सीधे विट्रियस गुहा में जीवों, दवाओं या अन्य पदार्थों को इंजेक्ट करने के लिए किया जाता है। यहां, हमने माउस की आंख में संक्रमण शुरू करने और इंट्राओक्यूलर बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने की तकनीक के लिए इस इंजेक्शन तकनीक का प्रदर्शन किया। बैसिलस सेरियस 18 घंटे के लिए मस्तिष्क हृदय जलसेक तरल मीडिया में उगाया गया था और एक एकाग्रता १०० कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) /0.5 μL को फिर से निलंबित कर दिया । एक C57BL/6J माउस केटामाइन और जाइलाज़ीन के संयोजन का उपयोग कर एनेस्थेटाइज्ड किया गया था । एक पिकालियर माइक्रोइंजेक्टर और ग्लास केशिका सुइयों का उपयोग करके, बेसिलस निलंबन के 0.5 माइक्रोन को माउस आंख के मध्य विट्रियस में इंजेक्ट किया गया था। कॉन्ट्रालेट्रल कंट्रोल आई को या तो बाँझ मीडिया (सर्जिकल कंट्रोल) के साथ इंजेक्ट किया गया था या इंजेक्शन (पूर्ण नियंत्रण) नहीं किया गया था। संक्रमण के बाद 10 घंटे में, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई थी, और आंखों को बाँझ सर्जिकल चिमटी का उपयोग करके काटा गया था और 400 माइक्रोन बाँझ पीबीएस और 1 मिमी बाँझ ग्लास मोती वाली ट्यूब में रखा गया था। ELISAs या myeloperoxidase परख के लिए, प्रोटीन अवरोधक ट्यूबों में जोड़ा गया था । आरएनए निकालने के लिए उपयुक्त लाइसिस बफर जोड़ा गया। आंखों को 1-2 मिनट के लिए एक ऊतक समरूप में समरूप किया गया था। होमोजेनेट को पीबीएस में 10 गुना तक क्रमिक रूप से पतला किया गया था और आगर प्लेटों पर पतला ट्रैक किया गया था। शेष समरूपों को अतिरिक्त परख के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। प्लेटों को 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था और प्रति आंख सीएलयू को मात्रा निर्धारित की गई थी । इन तकनीकों के परिणामस्वरूप माउस आंखों में प्रजनन योग्य संक्रमण होते हैं और व्यवहार्य बैक्टीरिया, मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और मेजबान और बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति के ओमिक्स के मात्रा की सुविधा प्रदान करते हैं।
Introduction
बैक्टीरियल एंडोफेथैल्माइटिस एक विनाशकारी संक्रमण है जो सूजन का कारण बनता है, और, यदि ठीक से इलाज नहीं किया जाता है, तो दृष्टि या अंधापन की हानि हो सकती है। एंडोफ्थल्माइटिस का परिणाम आंखों के अंदरूनी हिस्से में बैक्टीरिया के प्रवेश से होता है1,2,3, 4,5. एक बार आंख में, बैक्टीरिया दोहराने, विषाक्त पदार्थों और अन्य हानिकारक कारकों का उत्पादन, और नाजुक रेटिना कोशिकाओं और ऊतकों को अपरिवर्तनीय क्षति पैदा कर सकता है । सूजन के कारण नेत्र क्षति भी हो सकती है, भड़काऊ रास्तों के सक्रिय होनेके कारण आंख1,5,6के इंटीरियर में भड़काऊ सेल आमद होती है। एंडोफेथैल्माइटिस इंट्राओक्यूलर सर्जरी (पोस्ट-ऑपरेटिव), आंखों में एक मर्मज्ञ चोट (पोस्ट-ट्रॉमेटिक) या बैक्टीरिया के मेटास्टैटिक फैलने से एक अलग शारीरिक साइट (अंतर्जात)7,8,9,10के बाद हो सकता है। बैक्टीरियल एंडोफ्थल्माइटिस के उपचार में एंटीबायोटिक्स, एंटी-भड़काऊ दवाएं, या सर्जिकल हस्तक्षेप3,4,11शामिल हैं। यहां तक कि इन उपचारों के साथ, दृष्टि या आंख ही खो सकता है। बैक्टीरियल एंडोफेथैल्माइटिस के बाद दृश्य पूर्वानुमान आम तौर पर उपचार प्रभावशीलता, प्रस्तुति पर दृश्य तीक्ष्णता, और संक्रमित जीव की उग्रता के आधार पर भिन्न होता है।
बैसिलस सेरियस (बी सेरियस)प्रमुख जीवाणु रोगजनकों में से एक है जो पोस्ट-ट्रॉमेटिक एंडोफेथैल्माइटिस7,12का कारण बनता है। अधिकांश बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस मामलों में तेजी से पाठ्यक्रम होता है, जिसके परिणामस्वरूप कुछ दिनों के भीतर अंधापन हो सकता है। बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस की पहचान में जल्दी से विकसित होने वाली इंट्राओकुलर सूजन, आंखों में दर्द, दृश्य तीक्ष्णता की तेजी से कमी और बुखार शामिल हैं। B. मस्तिष्क अन्य बैक्टीरिया की तुलना में आंखों में तेजी से बढ़ता है जो आमतौर पर आंखों के संक्रमण का कारण बनता है2,4,12 और कई उग्रता कारकों के पास। इसलिए सफल चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए खिड़की अपेक्षाकृत कम 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25. इस संक्रमण के उपचार आमतौर पर अन्य कम उग्र रोगजनकों के कारण एंडोफेथैल्माइटिस के इलाज में सफल होते हैं, लेकिन बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस आमतौर पर महत्वपूर्ण दृष्टि हानि से पीड़ित रोगियों के 70% से अधिक परिणाम देता है। उन रोगियों में से लगभग 50% संक्रमित नेत्रों के 7,16, 22,23के लिए ईविसेरेशन या नाभिन सेगुजरतेहैं . बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस की विनाशकारी और तीव्र प्रकृति तत्काल और उचित उपचार के लिए कहती है। रोग विकास के अंतर्निहित तंत्रों को समझने में हाल की प्रगति ने हस्तक्षेप के संभावित लक्ष्यों की पहचान की है ,19,26,27. बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस के प्रायोगिक माउस मॉडल संक्रमण के तंत्र को समझने और संभावित चिकित्सीय परीक्षण करने में उपयोगी बने रहते हैं जो दृष्टि हानि को रोक सकते हैं।
बी सेरियस के साथ चूहों का प्रायोगिक इंट्राओकुलर संक्रमण एंडोफेथैल्माइटिस28के दौरान बैक्टीरियल और होस्ट कारकों के साथ-साथ उनकी बातचीत को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल रहा है। यह मॉडल एक पोस्ट-ट्रॉमेटिक या पोस्ट-ऑपरेटिव इवेंट की नकल करता है, जिसमें चोट के दौरान बैक्टीरिया को आंख में पेश किया जाता है। यह मॉडल अत्यधिक पुन: उत्पन्न करने योग्य है और प्रायोगिक चिकित्साओं के परीक्षण और देखभाल के मानक 1 , 6,19,29,30में सुधार के लिए आंकड़े उपलब्धकरानेके लिए उपयोगी रहा है । कई अन्य संक्रमण मॉडलों की तरह, यह मॉडल संक्रमण के कई मापदंडों के स्वतंत्र नियंत्रण के लिए अनुमति देता है और संक्रमण परिणामों की कुशल और प्रजनन योग्य परीक्षा को सक्षम बनाता है। पिछले कुछ दशकों में खरगोशों में इसी तरह के मॉडल में किए गए अध्ययनों ने आंखों में बी सेरियस उग्रता कारकों के प्रभावों की जांच की है2,4,13,14,31. बी सेरियस उत्परिवर्ती उपभेदों को व्यक्तिगत या कई उग्रता कारकों की कमी के इंजेक्शन द्वारा, रोग की गंभीरता में इन उग्रता कारकों के योगदान को विभिन्नघंटों के बाद के संक्रमण या दृश्य समारोह13, 14, 27, 31,32के नुकसान जैसे परिणामों द्वारा मापा जा सकता है। इसके अलावा , नॉकआउट माउस उपभेदों को संक्रमित करके इस मॉडल में मेजबान कारकों की जांच की गई है जिसमें विशिष्ट भड़काऊ मेजबान कारकों की कमी है26,29,33,34, 35. यह मॉडल संक्रमण के बाद आंखों में उपन्यास यौगिकों को इंजेक्शन लगाकर इस बीमारी के संभावित उपचारों का परीक्षण करने के लिए भी उपयोगी है30,36. इस पांडुलिपि में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें बी सेरियस केसाथ माउस आंख को संक्रमित करना, संक्रमण के बाद आंखों की कटाई करना, इंट्राओक्यूलर बैक्टीरियल लोड की मात्रा बताना और रोग गंभीरता के अतिरिक्त मापदंडों को परखने के लिए नमूनों को संरक्षित करना शामिल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां तक कि शक्तिशाली एंटीबायोटिक दवाओं, विरोधी भड़काऊ दवाओं, और विट्रेक्टॉमी सर्जरी की उपलब्धता के साथ, बैक्टीरियल एंडोफेथैल्माइटिस एक मरीज को अंधा कर सकता है। एंडोफ्थैल्माइटिस का अध्ययन करने में न?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक डॉ फेंग ली और मार्क Dittmar (OUHSC P30 लाइव एनिमल इमेजिंग कोर, डीन ए मैकजी आई इंस्टीट्यूट, ओकलाहोमा सिटी, ओके, यूएसए) को उनकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं । हमारे शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया है R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947, और R01EY024140. हमारे शोध को P30EY21725 (एनआईएच कोर ग्रांट फॉर लाइव एनिमल इमेजिंग एंड एनालिसिस, मॉलिक्यूलर बायोलॉजी और सेलुलर इमेजिंग) द्वारा भी समर्थन दिया गया है। हमारे शोध को एनईआई विजन साइंस प्री-डॉक्टोरल ट्रेनी प्रोग्राम 5T32EY023202, प्रेस्बिटेरियन हेल्थ फाउंडेशन रिसर्च सपोर्ट ग्रांट और डीन ए मैकजी आई इंस्टीट्यूट को रिसर्च से अंधापन रोकने के लिए अप्रतिबंधित अनुदान का भी समर्थन किया गया है।
Materials
| 2-20 µL pipette | RANIN | L0696003G | NA |
| 37oC Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | NA |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 90003-032 | NA |
| Cell Microinjector | MicroData Instrument, Inc. | PM2000 | NA |
| Fine tip forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-122 | NA |
| Glass beads 1.0 mm | BioSpec | 11079110 | NA |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | NB-I2400 | NA |
| Microcapillary Pipets 5 Microliters | Kimble | 71900-5 | NA |
| Micro-Pipette Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | NA |
| Microscope Axiostar Plus | Zeiss | NA | |
| Microscope OPMI Lumera | Zeiss | NA | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | NA |
| Multichannel pipette 30-300 µL | Biohit | 15626090 | NA |
| Multichannel pipette 5-100 µL | Biohit | 9143724 | NA |
| Needle/Pipette Puller | Kopf | 730 | NA |
| PBS | GIBCO | 1897315 | Molecular grade |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Molecular grade |
| Reverse action forceps | Katena | K5-8228 | NA |
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