Detta protokoll beskriver användningen av asymmetrisk flödesfält-flödesfraktion i kombination med UV-vis-detektion för bestämning av storleken på ett okänt guldnanopartiklarprov.
Partikelstorlek är utan tvekan den viktigaste fysikalisk-kemiska parametern i samband med begreppet nanopartikel. Exakt kunskap om nanopartiklarnas storlek och storleksfördelning är av yttersta vikt för olika tillämpningar. Storleksintervallet är också viktigt, eftersom det definierar den mest “aktiva” komponenten i en nanopartikeldos.
Asymmetrisk flödesfält-flödesfraktion (AF4) är en kraftfull teknik för storleksändring av partiklar i suspension i storleksområdet cirka 1-1000 nm. Det finns flera sätt att härleda storleksinformation från ett AF4-experiment. Förutom att koppla AF4 online med storlekskänsliga detektorer baserade på principerna för multivinklad ljusspridning eller dynamisk ljusspridning, finns det också möjlighet att korrelera storleken på ett prov med dess retentionstid med hjälp av ett väletablerat teoretiskt tillvägagångssätt (FFF-teori) eller genom att jämföra det med retentionstiderna för väldefinierade partikelstorleksstandarder (extern storlekskalibrering).
Vi beskriver här utvecklingen och den interna valideringen av ett standardrutiner (SOP) för storlek av ett okänt guldnanopartiklarprov av AF4 i kombination med UV-vis-detektion med hjälp av extern storlekskalibrering med nanopartiklar av guld i storleksintervallet 20–100 nm. Denna procedur ger en detaljerad beskrivning av det utvecklade arbetsflödet, inklusive provberedning, AF4-instrumentinställning och kvalificering, AF4-metodutveckling och fraktionering av det okända nanopartiklarprovet i guld samt korrelationen mellan de erhållna resultaten och den etablerade kalibreringen av den externa storleken. SOP som beskrivs här validerades så småningom framgångsrikt inom ramen för en interlaboratorisk jämförelsestudie som belyser AF4: s utmärkta robusthet och tillförlitlighet för storleksändring av nanopartikelprover i suspension.
Guldnanopartiklar (AuNP) i form av kolloidalt guld hade varit en del av den mänskliga kulturen långt innan det fanns en förståelse för vad nanopartiklar var och innan termen nanopartiklar hade hittat sin väg in i samtida, vetenskaplig vokabulär. Utan distinkt kunskap om deras nanoskala utseende, suspenderad AuNP hade redan använts för medicinska och andra ändamål i antika Kina, Arabien och Indien i V-VI århundradena BC1, och även de gamla romarna utnyttjade sin rubinröda färg för att berömt färga sin keramik i Lycurgus Cup-utställningen i British Museum2. I västvärlden, under århundradena från medeltiden till den moderna eran, användes suspenderade AuNP främst som färgämnen för glas och emalj (Lila av Cassius)3 samt för att behandla en mängd olika sjukdomar (Potable Gold), särskilt syfilis4.
Men alla dessa studier hade främst fokuserat på tillämpningen av suspenderad AuNP och det var upp till Michael Faraday 1857 att införa det första rationella tillvägagångssättet för att undersöka deras bildande, deras natur samt deras egenskaper5. Även om Faraday redan var medveten om att dessa AuNP måste ha mycket minimala dimensioner, var det inte förrän utvecklingen av elektronmikroskopi när explicit information om deras storleksfördelning vartillgänglig 6,7, vilket så småningom möjliggör korrelationen mellan storlek och andra AuNP-egenskaper.
Nuförtiden, tack vare deras ganska enkla och enkla syntes, anmärkningsvärda optiska egenskaper (ytplasmonresonans), god kemisk stabilitet och därmed mindre toxicitet samt deras höga mångsidighet när det gäller tillgängliga storlekar och ytmodifieringar, har AuNP hittat utbredda tillämpningar inom områden som nanoelektronik8,diagnostik 9,cancerbehandling10, eller läkemedelsleverans11. För dessa tillämpningar är naturligtvis exakt kunskap om storleken och storleksfördelningen för den tillämpade AuNP en grundläggande förutsättning för att säkerställa optimaleffekt 12 och det finns en betydande efterfrågan på robusta och tillförlitliga verktyg för att bestämma denna viktiga fysikalisk-kemiska parameter. Idag finns det en uppsjö av analytiska tekniker som kan dimensionera AuNP i suspension inklusive, till exempel UV-vis spektroskopi (UV-vis)13, Dynamic Light Scattering (DLS)14 eller Single Particle Inductively-Coupled Plasma Mass Spectrometry (spICP-MS)15 med Field-Flow Fractionation (FFF) som en nyckelspelare i detta fält16,17,18,19,20.
FFF konceptualiserades första gången 1966 av J. Calvin Giddings21och består av en familj av elueringsbaserade fraktioneringstekniker, där separation sker inom en tunn bandliknande kanal utan en stationär fas22,23. I FFF framkallas separation genom interaktion mellan ett prov och ett externt kraftfält som verkar vinkelrätt mot riktningen för ett laminärt kanalflöde, där provet transporteras nedströms vanligtvis mot respektive in-line-detektorer. Bland dessa relaterade FFF-tekniker har Asymmetrisk flödesfältflödesfraktion (AF4), där ett andra flöde (korsflöde) fungerar som kraftfält, blivit den mest använda undertypen24. I AF4 är kanalbotten (ackumuleringsväggen) utrustad med ett halvgenomsläppligt ultrafiltreringsmembran som kan behålla provet samtidigt som korsflödet kan passera genom membranet och lämna kanalen via ett extra utlopp. På så sätt kan korsflödet driva provet mot ackumuleringsväggen och därigenom motverka dess diffusionsinducerade flöde (brownsk rörelse). I en resulterande jämvikt mellan fält- och diffusionsinducerade flödet. Mindre provbeståndsdelar som uppvisar högre diffusionskoefficienter ligger närmare kanalcentret medan större provbeståndsdelar med lägre diffusionskoefficienter lokaliserar närmare ackumuleringsväggen. På grund av den paraboliska flödesprofilen inuti kanalen transporteras därför mindre provbeståndsdelar i kanalflödets snabbare laminae och eluerar före större provbeståndsdelar. Med hjälp av FFF retentionsparameter och Stokes-Einstein diffusionskoefficientekvationer kan elueringstiden respektive elueringsvolymen för ett prov i AF4 sedan översättas direkt till dess hydrodynamiskastorlek 22. Här hänvisar det beskrivna elueringsbeteendet till det normala elueringsläget och gäller vanligtvis för AF4 inom ett partikelstorleksområde mellan cirka 1–500 nm (ibland upp till 2000 nm beroende på partikelegenskaper och fraktioneringsparametrar) medan sterisk-hyperlayer-eluering vanligtvis inträffar över dennastorlekströskel 25.
Det finns tre vanliga sätt att härleda storleksinformation efter separation av FFF. Eftersom FFF är ett modulärt instrument kan det kombineras nedströms med flera detektorer som storlekskänsliga ljusspridningsdetektorer baserade på principen om multivinklad ljusspridning (MALS)26,27, Dynamic Light Scattering (DLS) 28,29,ellertill och med en kombination av båda för att få ytterligare forminformation30,31. Men eftersom retentionsbeteendet hos ett prov i en FFF-kanal i allmänhet styrs av väldefinierade fysiska krafter, kan storleken också beräknas med hjälp av ett matematiskt tillvägagångssätt (FFF-teori), där en enkel koncentrationsdetektor (t.ex. en UV-vis-detektor) är tillräcklig för att indikera närvaron av ett eluterande prov32,33.
Som ett tredje alternativ rapporterar vi här tillämpningen av en extern storlekskalibrering34,35 med väldefinierade AuNP-standarder i storleksintervallet 20-100 nm för storlek av ett okänt guldnanopartiklarprov i suspension med AF4 i kombination med UV-vis-detektion. Denna enkla experimentella inställning valdes med flit för att så många laboratorier som möjligt skulle kunna ansluta sig till en internationell interlaboratorisk jämförelse (ILC), som senare utfördes inom ramen för Europaparlamentets Horisont 2020-projekt ACEnano baserat på det protokoll som presenteras här.
Den hydrodynamiska storleken på en okänd AuNP bedömdes noggrant av AF4 tillsammans med en UV-vis-detektor med väldefinierade AuNP-storleksstandarder som sträcker sig från 20 nm till 100 nm. Den utvecklade AF4-metoden optimerades med hjälp av en konstant tvärflödesprofil för att upprätta ett linjärt samband mellan uppmätt retentionstid och AuNP-storlek, vilket möjliggör en enkel storleksbestämning från linjär regressionsanalys. Särskilt fokus låg också på att uppnå tillräckligt höga återvinningsgrader som inte tyder på någon betydande provförlust under fraktionering, och att den utvecklade AF4-metoden, inklusive den applicerade eluenten och membranet matchade väl med alla fraktionerade AuNP-prover.
Metodutveckling är utan tvekan det mest kritiska steget i AF4 och flera parametrar, inklusive kanaldimensioner, flödesparametrar samt eluent, membran, distanshöjd och till och med provegenskaper måste beaktas för att förbättra fraktionering inom ett givet elueringstidsfönster. Syftet med det här stycket är att vägleda läsaren genom de kritiska steg som optimerades för att framgångsrikt bestämma storleken på det okända AuNP-exemplet som diskuteras här. För en mer detaljerad beskrivning av hur man generellt utvecklar en AF4-metod hänvisas läsaren till AF4-avsnittet “ISO/TS21362:2018 – Nanoteknik – Analys av nanoobjekt med asymmetriskt flöde och centrifugalfältflödesfraktion”25. Med en närmare titt på de tillämpade fraktioneringsförhållandena i tabell 3är det första kritiska steget införandet och avslappningen av AuNP-provet i AF4-kanalen. Detta steg styrs av injektionsflödet, fokusflödet och korsflödet, vars samspel tvingar provet att lokalisera nära membranytan och koncentrera det i ett smalt band nära insprutningsporten på AF4-kanalen som i princip definierar fraktioneringens startpunkt. En tillräcklig avslappning av provet är obligatorisk eftersom provbeståndsdelar av olika storlekar under detta steg lokaliserar i olika höjder på AF4-kanalen och därigenom utgör grunden för en framgångsrik storleksfraktion. Ofullständig provavslappning är vanligtvis synlig genom ett ökat tomrum toppområde som härrör från oreda (dvs. icke-avslappnade) provbeståndsdelar. Denna effekt kan mildras genom att öka injektionstiden och/eller det applicerade korsflödet. Båda parametrarna behöver dock noggrann optimering, särskilt för prover som är benägna att tätbebyggelse och adsorption på AF4-membranet, och kan övervakas av respektive återvinningsgrad som erhållits för olikaparameterinställningar 36,37. Den applicerade injektionstiden på 5 min tillsammans med ett korsflöde på 1,0 mL▼min-1 visade återvinningshastigheter >80% för alla AuNP-prover och ett försumbart tomrum toppområde som indikerar nästan optimala avslappningsförhållanden. Efter tillräcklig avslappning av AuNP-provet stoppades fokusflödet och provtransport längs AF4-kanallängden till respektive UV-vis-detektor initierades som representerar det andra kritiska steget. För att säkerställa tillräckligt hög fraktioneringseffekt vid rimliga analystider tillämpades en konstant tvärflödeshastighet på1,0 mL▼min -1 i 30–50 min (beroende på respektive fraktionerad AuNP-storleksstandard) följt av ett 10 minuters linjärt korsflödesförfall med en detektorflödeshastighet på 0,5 mL.min-1. Med hjälp av en konstant korsflödesprofil över separationen av alla Standarder för AuNP-storlek visade ett linjärt samband mellan retentionstid och AuNP-storlek efter FFF-teori22, vilket möjliggör storleksbestämning av det okända AuNP-provet genom enkel linjär regressionsanalys. Men andra profiler än ett konstant korsflöde har också utnyttjats för storleksstorlek av nanopartiklar, vilket i slutändan leder till ett icke-linjärt förhållande mellan retentionstid ochpartikelstorlek 38,39. Dessutom är storleksbestämning i AF4 med hjälp av väldefinierade storleksstandarder inte begränsad till AuNP, utan kan också tillämpas på nanopartiklar med andra storlekar och elementär sammansättning (t.ex. silver38,40 eller kiseldioxidnanopartiklar41,42). Dessutom, när man arbetar med utspädda prover, är ICP-MS en mycket känslig elementär detektor, som kan kopplas till AF4, vilket ökar mångsidigheten i denna analytiska metod för dimensionering av ett stort antal nanopartiklar i suspension.
Trots sin utbredda tillämpning har kalibrering av extern storlek med väldefinierade storleksstandarder i AF4 vissa särdrag som måste beaktas när man använder den för korrekt storlek av okända prover. För det första är den starkt beroende av tillämpningen av jämförbara villkor under fraktionering av respektive storleksnormer och det faktiska urvalet. I det fall som presenteras här är det därför obligatoriskt att både AuNP-storleksstandarderna och det okända AuNP-provet fraktioneras med samma AF4-metod samt samma eluent och samma membran vilket gör detta tillvägagångssätt ganska oflexibelt. Eftersom det inte finns några storlekskänsliga detektorer, t.ex. Detta gäller särskilt för okända prover som uppvisar mycket breda storleksfördelningar, där det fortfarande är oklart om alla provbeståndsdelar följer det normala elueringsmönstret: fraktionering från mindre till större partiklar, eller om större provbeståndsdelar redan eluerar i steriskt hyperlagerläge och därmed potentiellt co-eluting med mindreprovbeståndsdelar 43,44. Dessutom har även om FFF-teorin betonar att AF4 separerar enbart baserat på skillnader i hydrodynamisk storlek med partiklar som betraktas som punktmassor utan några interaktioner med deras miljö22, kan verkligheten spela en annan historia med partikel-partikel- och partikelmembraninteraktioner (såsom elektrostatisk attraktion / repulsion eller van-der-Waals-attraktion) spela en betydande roll och kan potentiellt införa en mätbar partiskhet i storleksbestämningar via extern storlekskalibrering45,46. Det rekommenderas därför att använda storleksstandarder som idealiskt matchar sammansättningen och ytegenskaperna (Zeta-potentialen) hos den partikel som är av intresse40,42 eller, Om dessa inte är tillgängliga, använd åtminstone väl karakteriserade partikelstorleksstandarder (t.ex. polystyren latexpartiklar) och noggrant utvärdera deras jämförbarhet med den intressepartikel som är särskilt när det gäller deras yta Zeta potential i respektive miljö, där analysen ska utföras41,47.
Mångsidigheten hos AF4 anses ofta vara dess största styrka, eftersom den erbjuder ett applikationsintervall som går utöver de flesta andra vanliga storlekstekniker inom detta område22,48,49. Samtidigt, på grund av dess associerade förmodligen komplexitet, kan det också betraktas som dess mest betydande nackdel, särskilt mot snabba och skenbart lättanvända storlekstekniker som DLS, Nanopartikelspårningsanalys eller enstaka partikel ICP-MS. Men när AF4 sätts i perspektiv med dessa populära storlekstekniker blir det tydligt att alla tekniker har sina för- och nackdelar, men alla bidrar till en mer omfattande förståelse för nanopartiklarnas fysikalisk-kemiska karaktär och bör därför betraktas som komplementära snarare än konkurrenskraftiga.
Standarddriftsförfarandet (SOP) som presenteras här belyser af4-UV-vis utmärkt tillämplighet med extern storlekskalibrering för storleksändring av ett okänt AuNP-prov i suspension och tillämpades så småningom som en rekommenderad riktlinje för AF4-analys av ett okänt AuNP-prov inom en internationell interlaboratorisk jämförelse (ILC) som genomfördes inom ramen för Horizon 2020-projektet, ACEnano (resultatet av detta ILC kommer att bli föremål för en framtida publikation). Detta protokoll bidrar därför till de uppmuntrande och pågående internationella ansträngningarna för att validera och standardisera AF4-metoderna25,50,51,52 som understryker AF4:s lovande potential på området nanopartikelkarakterisering.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka hela ACEnano-konsortiet för givande diskussioner i alla skeden av utarbetandet av protokollet som presenteras här. Författarna uppskattar också finansieringen från Europeiska unionens Horisont 2020-program (H2020) enligt bidragsavtal nr 720952 inom ramen för ACEnano-projektet.
0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF) | Postnova Analytics GmbH | Z-FIL-TEF-002 | Used for filtration of aqueous solutions |
0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm) | Merck Millipore | Durapore Millex | Used for filtration of NovaChem100 |
Adjustable Volume Pipettes (1000 µL) | Eppendorf AG | Research Plus | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
AF4 cartridge | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF – AF4 Analytical Channel | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
AF4 Membrane – Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO) | Postnova Analytics GmbH | Z-AF4-MEM-612-10KD | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Analytical Balance (0.1 mg precision) | Sartorius | ENTRIS124I-1S | Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution |
Autosampler | Postnova Analytics GmbH | PN5300 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Channel Oven | Postnova Analytics GmbH | PN4020 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Crossflow Module | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF Control Module | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Disposable Pipette Tips (1000 µL) | Eppendorf AG | ep T.I.P.S | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
Flasks (e.g. 2 liter volume) | neoLab | 1-0199 | Used for eluent storage |
Focus Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1131 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | VIA-002 | Used for sample storage |
Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) | Postnova Analytics GmbH | NovaCal Gold | 50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function |
Magnetic Stirrer | IKA | VIBRAX-VXR | Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW |
Personal Computer (PC) | Dell Technologies | / | Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.) | / | / | In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials |
Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | Z-VIA-09150868 | Used for sample storage |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting Grade | Carl Roth GmbH & Co KG | 2326.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.a | Carl Roth GmbH & Co KG | 6771.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
Software Package for Control and Data Acquisition | Postnova Analytics GmbH | NovaFFF AF2000 Software | Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
Software Package for Data Evaluation | Postnova Analytics GmbH | NovaAnalysis Software | Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual |
Software Package for final Data Processing | OriginLab Corporation | Origin 2019 | Used for final data processing |
Solvent Degasser | Postnova Analytics GmbH | PN7520 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Solvent Selector | Postnova Analytics GmbH | PN7310 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Solvent Organizer | Postnova Analytics GmbH | PN7140 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Surfactant Mixture | Postnova Analytics GmbH | NovaChem100 | Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation |
Tip Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1130 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Unknown AuNP sample | BBI Solutions | EM.GC60 | 60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function |
UV-vis Detector | Postnova Analytics GmbH | PN3211 | UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system |
Vacuum Filtration Unit | Postnova Analytics GmbH | Eluent Filtration System | Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions |
Vortex | IKA | Vortex Genie 2 | Used for homogenization of diluted AuNP suspensions |
Water Purification System | Merck Millipore | Milli-Q Integral 5 | Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions |